痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2及NLRP3炎性體的變化

田 嵐

四川省綿陽市中心醫(yī)院免疫科，四川 綿陽 621000

痛風(fēng)是臨床上常見的代謝性疾病，該病的特征是血尿酸水平升高、尿酸鹽在關(guān)節(jié)軟骨以及腎臟等部位沉積，會引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎以及痛風(fēng)性腎病。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是痛風(fēng)患者最突出的臨床表現(xiàn)，關(guān)節(jié)炎的發(fā)生不僅與嘌呤代謝障礙、尿酸鹽局部沉積有關(guān)，還與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)異常有關(guān)[1]。目前，關(guān)于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，包括遺傳因素、代謝因素、免疫因素均與疾病的發(fā)生有關(guān)[2]。新近的研究認(rèn)為，局部沉積的尿酸鹽可以作為一種內(nèi)源性危險信號來激活免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成疾病的發(fā)生[3]。端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白1（TRF1）、端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白2（TRF2）通過調(diào)節(jié)端粒的長度來影響免疫反應(yīng)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NLRP3）通過激活白介素1β（IL-1β）來影響炎性反應(yīng)。本研究分析了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2及NLRP3炎性體的變化趨勢。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年6月～2015年3月在綿陽市中心醫(yī)院免疫科（以下簡稱“我院”）就診的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎90例患者，其中急性期、慢性期、間歇期患者各30例，所有患者均符合美國風(fēng)濕學(xué)會制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)；選擇同期在我院體檢的30例健康者作為對照。急性期患者中男 18 例、女 12 例，年齡（57.58±6.69）歲；慢性期患者中男 21例、女 9例，年齡（58.12±5.58）歲；間歇期患者中男 19 例、女 11 例，年齡（58.32±6.20）歲；對照中男20例、女 10例，年齡（57.74±6.35）歲。各組一般資料的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者和/或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 4℃低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司），熒光定量PCR 儀（ABI公司），酶標(biāo)儀（Bio-rad公司）；淋巴細(xì)胞分離液（GE公司），人IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（Roche公司），RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒（Takara公司）。

1.2.2 標(biāo)本采集方法 抽取病理組和對照組受試者的晨起空腹靜脈血6 mL，分為兩份。一份室溫靜置凝血后，3000 r/min離心10 min得到血清；另一份用肝素抗凝，加入淋巴細(xì)胞分離液后離心，抽取懸浮在中層的單個核細(xì)胞。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗 取血清標(biāo)本，按照人IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書中的操作步驟配制蛋白濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品、適當(dāng)稀釋血清標(biāo)本，而后進(jìn)行點樣、抗體孵育、洗板等操作，最后在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的吸光值（OD值）。根據(jù)蛋白濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品的OD值制作蛋白濃度-OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，而后將血清標(biāo)本的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度。

1.2.4 RNA抽提及PCR擴(kuò)增實驗 取外周血單個核細(xì)胞，采用RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞中的RNA，紫外分光光度計測定濃度后取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到 cDNA樣本后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，NLRP3、ASC、Caspase1、TRF1、TRF2、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原（LFA1）的引物序列根據(jù)文獻(xiàn) [4-6]，經(jīng)溶解曲線驗證后用于實驗。PCR擴(kuò)增條件：95℃、10 s，特異性退火溫度15 s，72℃，25 s，循環(huán) 40次。根據(jù) PCR擴(kuò)增曲線計算mRNA含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血單個核細(xì)胞中NLRP3炎性體的含量

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中NLRP3、ASC、Caspase1的mRNA含量高于健康者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。急性期患者外周血單個核細(xì)胞中 NLRP3、ASC、Caspase1的 mRNA含量高于慢性期、間歇期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；慢性期患者外周血單個核細(xì)胞中NLRP3、ASC、Caspase1的mRNA含量高于間歇期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見表 2。

表1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者和健康者外周血單個核細(xì)胞中NLRP3 炎性體的含量比較（）

表1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者和健康者外周血單個核細(xì)胞中NLRP3 炎性體的含量比較（）

注：NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3；ASC：凋亡相關(guān)斑點樣蛋白；Caspase1：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1

類型 例數(shù) NLRP3 ASC Caspases-1痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者健康者t值P值90 30 242.34±30.58 100±14.85 12.394＜0.05 265.68±19.48 100±15.04 14.039＜0.05 301.23±35.69 100±12.91 18.948＜0.05

表2 不同病情嚴(yán)重程度痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中NLRP3 炎性體的含量比較（）

表2 不同病情嚴(yán)重程度痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中NLRP3 炎性體的含量比較（）

注：NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3；ASC：凋亡相關(guān)斑點樣蛋白；Caspase1：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1

病情嚴(yán)重程度 例數(shù) NLRP3 ASC Caspases-1急性期慢性期間歇期F值P值30 30 30 339.12±42.35 265.96±29.40 172.43±20.14 12.394＜0.05 329.16±42.12 255.48±27.69 189.24±20.59 14.039＜0.05 389.57±45.14 302.39±36.86 225.68±30.13 18.948＜0.05

2.2 血清中IL-1β的含量及其與NLRP3炎性體含量的相關(guān)性

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清中IL-1β含量[（78.69±9.04）ng/L]高于健康者[（13.84±2.03）ng/L]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=27.583，P ＜ 0.05）；急性期、慢性期、間歇期患者血清中 IL-1β 含量分別為（123.95±15.86）、（80.30±10.29）、（42.39±5.59）ng/L， 急性期患者血清中 IL-1β含量高于慢性期、間歇期患者，慢性期患者血清中IL-1β量高于間歇期患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Pearson相關(guān)性分析顯示，血清中IL-1β含量與外周血單個核細(xì)胞中NLRP3、ASC、Caspase1的含量呈正相關(guān)（r=0.882、0.718、0.784，P ＜ 0.05）。

2.3 外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2的含量

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2的mRNA含量高于健康者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。急性期患者外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2的mRNA含量高于慢性期、間歇期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；慢性期患者外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2的mRNA含量高于間歇期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表3 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者和健康者外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2 的含量比較（）

表3 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者和健康者外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2 的含量比較（）

注：TRF1：端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白1；TRF2：端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白2

類型 例數(shù) TRF1 TRF2痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者健康者90 30 t值 P值189.34±23.39 100.00±13.95 8.498＜0.05 238.59±30.18 100.00±15.04 12.579＜0.05

表4 不同病情嚴(yán)重程度痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2 的含量比較（）

表4 不同病情嚴(yán)重程度痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2 的含量比較（）

注：TRF1：端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白1；TRF2：端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白2

病情嚴(yán)重程度 例數(shù) TRF1 TRF2急性期患者慢性期患者間歇期患者F值P值30 30 30 284.22±30.14 209.48±24.41 140.23±18.19 10.495＜0.05 318.59±34.58 248.52±27.59 168.92±20.14 9.592＜0.05

2.4 外周血中LFA-1的含量及其與TRF1、TRF2含量的相關(guān)性

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血中LFA-1含量[（78.69±9.34）ng/L]高于對照組[（13.84±2.03）ng/L]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=31.283，P ＜ 0.05）。急性期、慢性期、間歇期患者血清中 LFA-1 含量分別為（123.93±15.85）、（80.3±10.29）、（42.39±5.59）ng/L，急性期患者外周血中 LFA-1含量高于慢性期、間歇期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），慢性期患者外周血中LFA-1含量高于間歇期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Pearson相關(guān)性分析顯示，外周血中LFA-1含量與外周血單個核細(xì)胞中TRF1、TRF2的含量呈正相關(guān) （r=0.748、0.842，P ＜ 0.05）。

3 討論

NLRP3是一類胞質(zhì)型模式識別受體，能夠與ASC以及Caspase1形成NLRP3炎性體，通過識別MSU等配體后參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控[7-8]。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由尿酸鹽微晶體沉積所造成的關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)性疾病，局部炎性反應(yīng)增強(qiáng)、炎癥介質(zhì)大量募集是疾病突出的病理特征。NLRP3炎性體作為炎性反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因素，可能參與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[9]。本研究對痛風(fēng)患者外周血中NLRP3炎性體含量的分析發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)患者外周血中NLRP3、ASC、Caspase1的含量高于對照組且呈現(xiàn)急性期患者＞慢性期患者＞間歇期患者。這就說明NLRP3炎性體所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生以及病情的發(fā)展。

NLRP3炎性體的作用是將白細(xì)胞介素IL-1β前體剪切為IL-1β成熟體并分泌至細(xì)胞外，進(jìn)而參與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)過程[10-11]。IL-1β是體內(nèi)炎性反應(yīng)的始動因子，能夠激活炎性反應(yīng)、招募炎癥細(xì)胞并增加炎癥介質(zhì)的釋放[12]；國外學(xué)者的研究證實，IL-1β不僅在尿酸鈉晶體沉積組織中具有放大炎性反應(yīng)的作用，還能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞與軟骨細(xì)胞相互作用、加速軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程[13-14]。本研究對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清中IL-1β進(jìn)行了檢測并分析了NLRP3炎性體與IL-1β含量的相關(guān)性，結(jié)果顯示：痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清中IL-1β的含量高于對照組且與NLRP3、ASC、Caspase1的含量呈正相關(guān)。由此證實NLRP3炎性體所介導(dǎo)的IL-1β含量增多參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

TRF1和TRF2是一類端粒保護(hù)蛋白，參與端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體的構(gòu)成，能夠?qū)Χ肆ｉL度實現(xiàn)負(fù)調(diào)控[15]。TRF1和TRF2發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的方式是通過Myb結(jié)構(gòu)域粘附在端粒末端序列上，而后募集其他分子來組成端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體，進(jìn)而阻礙端粒酶與DNA序列的黏附、抑制端粒結(jié)構(gòu)的延長[16]。有研究表明，在自身免疫性疾病發(fā)生過程中，端粒結(jié)構(gòu)顯著延長、端粒酶活性顯著升高并且與淋巴細(xì)胞的活化存在相關(guān)性[17]。本研究對痛風(fēng)患者外周血中TRF1和TRF2含量的分析顯示，痛風(fēng)患者外周血中TRF1和TRF2的含量高于對照組且呈現(xiàn)急性期患者＞慢性期患者＞間歇期患者的趨勢。這就說明TRF1和TRF2所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)異常參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生以及病情的發(fā)展。

TRF1和TRF2最主要的功能是負(fù)向調(diào)節(jié)端粒長度，關(guān)于TRF1和TRF2如何參與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程仍未明確。有研究顯示，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血中單核巨噬細(xì)胞、多核中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的端粒長度明顯縮短。上述細(xì)胞能夠合成多種細(xì)胞因子來參與免疫功能的調(diào)節(jié)[18]。其中，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原（LFA-1）對于免疫相關(guān)細(xì)胞的局部浸潤具有正向調(diào)控作用[19-20]，本研究對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血中LFA-1含量的分析可知：痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血中LFA-1的含量高于對照組且與TRF1、TRF2的含量呈正相關(guān)。由此證實TRF1和TRF2所介導(dǎo)的LFA-1高表達(dá)參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

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