Cr（Ⅵ）鹽脅迫下小麥種子中淀粉酶活性的響應

張艷杰　李桂玲　王金水等

摘要：研究重金屬離子Cr（Ⅵ）在不同濃度下對小麥種子萌發及其幼苗生長的影響。結果表明：Cr（Ⅵ）對小麥種子萌發和幼苗生長影響的臨界值為18 mg/L，即濃度低于18 mg/L的Cr（Ⅵ）促進小麥種子的萌發和幼苗的生長，高于 18 mg/L則抑制小麥種子的萌發和幼苗的生長；Cr（Ⅵ）對根生長的抑制作用大于對芽生長的抑制作用；高濃度的 Cr（Ⅵ） 對小麥種子萌發和幼苗生長的抑制是通過抑制淀粉酶的活性來實現的。

關鍵詞：Cr（Ⅵ）；小麥種子；萌發；淀粉酶；同工酶

中圖分類號： Q946.5；Q945.78 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0073-03

鉻（chromium，Cr）是自然環境中存在的1種重金屬元素，同時也是1種重要的環境污染物，被列為工業“五毒”之一。鉻在自然界中主要以三價鉻（Cr3+）、六價鉻[Cr（Ⅵ）]的化合物形式存在，且后者的毒性比前者更強[1-2]。已有研究證明，Cr（Ⅵ）不是植物生長發育的必需元素，在植物體內過量積累對植物的生長發育有明顯的抑制作用[3]。近年來，隨著印染、電鍍、化工、電子等行業的發展，越來越多的含鉻廢水、廢渣被排放到水體中，導致農田灌溉用水污染嚴重，進而對農作物的生長發育造成了巨大傷害，這不僅降低了農產品的產量和品質，而且能夠通過食物鏈進入人體，危害人類健康[4]。

小麥（Triticum aestivum Linn.）是我國重要的糧食作物，對于小麥的研究具有重要的經濟價值和現實意義，其產量和品質也越來越受到關注[5]。有關調查顯示，受重金屬污染的農田耕地面積占總耕地面積的1/5，其中受鉻污染的尤為嚴重[6]，因此研究鉻污染對小麥種子生長發育的影響極其重要。

目前，關于Cr（Ⅵ）鹽對小麥生長發育影響的研究多數是集中在對萌發及幼苗生長階段形態學指標的檢測分析方面，而關于Cr（Ⅵ）鹽對小麥不同發育階段形態指標的影響是如何實現的研究則鮮有報道。本研究圍繞這一問題，以小麥為試驗材料，采用室內水培法對小麥施以不同濃度梯度的Cr（Ⅵ）溶液，研究Cr（Ⅵ）鹽對小麥種子萌發及幼苗生長期間關鍵酶——淀粉酶活性的影響，以期為重金屬Cr（Ⅵ）對小麥生長毒害機理的研究，以及耐、抗重金屬Cr（Ⅵ）鹽品種的選育提供理論支持和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥選用溫麥6號，產自河南省黃泛區農場。試劑為華美生物工程公司生產的重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理與試驗設計 挑選大小均一、籽粒飽滿的溫麥6號種子，先用5%H2O2處理5 min進行表面消毒，然后用蒸餾水沖洗3～5遍，再加蒸餾水沒過種子最上層2 cm左右，浸種12 h。將小麥種子腹溝向下排列在鋪有雙層濾紙的培養皿中，每皿40粒，使每粒種子間留有均勻的間距，以防發霉種子對健康種子的感染。在培養皿中分別加入5 mL不同梯度濃度（3、5、10、15、18、20、25、30 mg/L，以Cr（Ⅵ）計）的K2Cr2O7溶液；對照（CK）用蒸餾水培養，每個濃度梯度均設置6個重復，置于室溫、自然光照下培養萌發，處理時間分別為3、7 d。所設的6個重復中3個重復用于培養3 d的形態學和生理指標測定；另外3個重復用于培養7 d的形態學和生理學指標測定。

1.2.2 形態學指標的測定 測定培養3、7 d小麥的芽長、根長。記錄的數據用Excel 2003進行成組數據t檢驗的統計分析。

1.2.3 生理學指標測定 待種子培養3、7 d后，分別去掉種皮，稱取0.5 g置于預冷的研缽中，加入少量石英砂和2 mL蒸餾水，研磨勻漿后轉入10 mL離心管中，用蒸餾水定容至10 mL，4 ℃、10 000 r/min條件離心15 min，上清液即為粗酶液。取上清液，4 ℃下保存備用。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）測定萌發種子淀粉酶同功酶活性，分離膠濃度為7.2%，濃縮膠濃度為3.2%[7]。于日光燈下觀察記錄酶譜，用數碼相機進行拍照。須要測量的數據有脫色前后膠長、指示劑游動距離、酶帶長。計算遷移率相關公式為V=mE。式中：V為溶液中帶電粒子的移動速度，cm/s；m為粒子的有效遷移率，cm3/（V·s）；E為電場，V/m。同時，采用分光光度法（3，5-二硝基水楊酸法）測定萌發種子的α-淀粉酶同工酶活性[8]。

2 結果與分析

2.1 Cr（Ⅵ）溶液對小麥主要形態學指標的影響

2.1.1 Cr（Ⅵ）溶液對小麥胚芽的影響 如圖1所示，用不同濃度梯度Cr（Ⅵ）鹽處理后，萌發3 d的小麥胚芽芽長在低濃度處理時略高于對照；相反，在高濃度處理時比對照低。與對照相比，Cr（Ⅵ） 處理濃度為3～15 mg/L時，可以刺激小麥胚芽的生長，對小麥胚芽生長起到了促進作用，其中處理濃度在 10 mg/L 時對小麥胚芽的生長有極顯著的促進作用；當 Cr（Ⅵ） 處理濃度提高至18 mg/L時，小麥胚芽的長度開始呈現下降趨勢，芽長與對照基本相同；處理濃度為20 mg/L時，小麥種子胚芽的生長受到了極顯著的抑制；隨著Cr（Ⅵ）鹽濃度的繼續升高，受抑制程度更為嚴重，結果見表1。處理7 d的小麥胚芽生長規律與處理3 d的小麥胚芽生長規律總體趨勢表現一致，結果如圖2所示。因此推測，18 mg/L的Cr（Ⅵ）處理濃度為影響小麥種子萌發和幼苗生長的臨界值。

2.1.2 Cr（Ⅵ）溶液對小麥胚根的影響 用不同濃度梯度的Cr（Ⅵ）處理后，與對照相比，對萌發3、7 d的小麥胚根的生長均有抑制作用，且均達到了極顯著水平，結果見圖1、圖2、表1。這說明用不同濃度Cr（Ⅵ）處理后，小麥胚根的生長狀況與胚芽不同；高濃度（>18 mg/L）的Cr（Ⅵ）處理時，Cr（Ⅵ）濃度越高，抑制效應越強，且對小麥種子胚根生長的抑制作用大于胚芽。

2.2 Cr（Ⅵ）溶液對小麥生長發育過程中關鍵酶淀粉酶活性的影響

2.2.1 Cr（Ⅵ）溶液對小麥幼苗生長過程中淀粉酶同工酶活性的影響 如圖3所示，不同濃度Cr（Ⅵ）處理7 d 的小麥總淀粉酶同功酶譜帶共有6條，依次標為a、b、c、d、e、f。與對照相比，Cr（Ⅵ）處理濃度為3～15 mg/L時，6條同工酶的譜帶寬度和亮度均高于對照，且在10 mg/L時的譜帶最寬、亮度最強；Cr（Ⅵ）處理濃度為18 mg/L時，6條同工酶譜帶寬度、亮度基本和對照相同；Cr（Ⅵ）處理濃度為20～30 mg/L時，a、d、e、f 4條同工酶的表達均受到不同程度的抑制，尤其是處理濃度達到 30 mg/L 時，a、b 2條譜帶消失，d、e、f 3條同工酶譜帶明顯變淺、變窄。結果表明，隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高，小麥幼苗生長過程中淀粉酶同工酶的活性與表達呈現先增后降特征；總體變化趨勢與Cr（Ⅵ）處理后小麥種子胚芽的生長規律基本一致，其中高濃度Cr（Ⅵ）（>18mg/L）處理時對淀粉酶同工酶的抑制作用同于對胚根的抑制作用?？傮w結果說明，Cr（Ⅵ）處理對小麥生長發育的影響可能是通過影響淀粉酶活性來實現的。

2.2.2 Cr（Ⅵ）溶液對小麥α-淀粉酶活性的影響 α-淀粉酶是植物種子萌發過程中產生的重要酶，因此其活性的高低與種子活力大小、種子是否能夠萌發密切相關。如圖4所示，Cr（Ⅵ）處理3、7 d的小麥α-淀粉酶活性變化趨勢基本一致，都隨著Cr（Ⅵ）處理濃度的升高呈先升后降趨勢，且活性都在 15 mg/L Cr（Ⅵ） 處理時達到最大值。與對照相比，Cr（Ⅵ）處理3 d 的小麥α-淀粉酶活性在Cr（Ⅵ）處理濃度為30 mg/L時受到抑制，處理濃度為3～25 mg/L均提高了α-淀粉酶活性；Cr（Ⅵ）處理7 d后，小麥幼苗的α-淀粉酶活性在25 mg/L時開始受到抑制，此后繼續升高Cr（Ⅵ）處理濃度，α-淀粉酶活性受到更強抑制。這與小麥胚芽生長的受抑制濃度略有差異，但與培養7 d的淀粉酶同工酶垂直電泳檢測結果基本一致。

3 結論

試驗結果表明，低濃度Cr（Ⅵ）處理對小麥種子的萌發有一定的促進作用，Cr（Ⅵ）濃度低于18 mg/L時，小麥胚芽的芽長以及淀粉酶同工酶活性與對照相比均有所提高；Cr（Ⅵ）濃度高于18 mg/L時，小麥苗芽與淀粉酶同工酶活性都受到了抑制，且隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高，抑制作用更強。因此可以認為，18 mg/L為臨界值，總體表現出“低促高抑”特點。這與李桂玲等在研究Cr3+處理對小麥種子幼苗的影響以及黃輝等研究Cr（Ⅵ）處理玉米幼苗中得到的結果一致[9-10]。此外，高濃度Cr（Ⅵ）處理時，小麥種子胚根生長的受抑制程度大于胚芽[11]，且對小麥同種器官在不同生長發育階段抑制作用不同，后期抑制程度更大。原因可能是種子胚根部位最先突破種皮暴露在Cr（Ⅵ）溶液中，隨著胚根受Cr（Ⅵ）脅迫時間延長，積累量越多，因此從宏觀上表現出受到更嚴重的傷害。

植物種子萌發需要足夠的物質和能量來源，小麥等禾谷類植物種子的主要貯藏物質是淀粉，通過淀粉酶水解淀粉獲得能源物質進而完成種子的萌發，這個過程中淀粉酶活性至關重要[12-13]。本試驗結果表明，低濃度（3～15 mg/L） Cr（Ⅵ） 處理時，萌發7 d的小麥淀粉酶同工酶活性逐漸升高，使得淀粉的水解速度加快從而促進小麥種子胚芽的生長；當Cr（Ⅵ）鹽濃度大于18 mg/L時，淀粉酶同工酶活性開始降低，相應的小麥種子胚芽的生長受到了抑制，芽長均低于對照；高濃度Cr（Ⅵ）處理時，小麥α-淀粉酶活性也受到了不同程度的抑制，表現為小麥胚根胚芽的生長受到抑制。有學者研究了小麥和水稻種子萌發階段同工酶的表達，結果證明淀粉酶活性變化趨勢反映了實生苗的形態學變化[14-15]。因此，Cr（Ⅵ） 鹽對小麥種子萌發的影響可能是通過影響小麥種子中淀粉酶活性來實現的，但是關于Cr（Ⅵ）鹽如何作用于淀粉酶活性部位，以及高濃度Cr（Ⅵ）鹽如何引起淀粉酶活性下降等問題的分子機理值得進行進一步的研究。

參考文獻：

[1]Becquer T，Quantin C，Sicot M，et al. Chromium availability inultramafic soils from New Caledonia[J]. Science of the Total Environment，2003，301（1/2/3）：251-261.

[2]張義賢. 三價鉻和六價鉻對大麥毒害效應的比較[J]. 中國環境科學，1997，17（6）：565-568.

[3]Shanker A K，Cervantes C，Loza-Tavera H，et al. Chromium toxicity in plants[J]. Environment International，2005，31（5）：739-753.

[4]李 天，來航線，和文祥，等. Cr（Ⅵ）的土壤酶效應研究[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2012，40（8）：171-178.

[5]馬鴻翔，王龍俊，姚金保，等. 江蘇小麥品質現狀與提升策略[J]. 江蘇農業學報，2013，29（3）：468-473.

[6]宋 波，高 定，陳同斌，等. 北京市菜地土壤和蔬菜鉻含量及其健康風險評估[J]. 環境科學學報，2006，26（10）：1707-1715.

[7]李 勤. 谷物萌發前后淀粉酶活力的比較[J]. 廣西輕工業，2007，23（5）：9-10.

[8]王學奎. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 2版. 北京：高等教育出版社，2006：174-176.

[9]李桂玲，李明澤，李歡慶，等. Cr3+對小麥種子萌發及幼苗生長的影響[J]. 江蘇農業科學，2009（4）：115-116.

[10]黃 輝，高 峽，王 娟. 六價鉻對玉米幼苗生長及抗氧化系統的影響[J]. 農業環境科學學報，2011，30（4）：633-638.

[11]李麗君，鄭普山，周懷平，等. 鉻對玉米種子萌發的影響[J]. 山西農業科學，2001，29（2）：32-34.

[12]陳禪友，劉 磊. 長豇豆種子萌發進程中生理生化指標動態變化[J]. 種子，2006，25（9）：30-33.

[13]何俊瑜，任艷芳. 鎘脅迫對水稻種子萌發、幼苗生長和淀粉酶活性的影響[J]. 華北農學報，2008，23（增刊1）：131-134.

[14]Umemura T，Perata P，Futsuhara Y，et al. Sugar sensing and alpha-amylase gene repression in rice embryos[J]. Planta，1998，204（4）：420-428.

[15]Cejudo F J，Cubo M T，Baulcombe D C. Amyl expression during wheat seed germination[J]. Plant Science，1995，106（2）：207-213.