植物組織培養生理機制的研究進展

張慧君　陳勁楓

摘要：植物形態發生變化時，生理生化特性研究是揭開這一現象的一個重要方面，很多研究已經證實，形態建成的前提是植物生理生化的改變，其生理生化差異導致了不同的形態發生，植物不定芽形成是一個很復雜的現象。本研究就植物組織培養過程中生理生化變化的幾個方面加以討論。

關鍵詞：植物組織培養；生理生化；生理機制；形態；不定芽；內源激素

中圖分類號：Q943.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0033-03

作為植物細胞全能性的一種表達方式，體細胞胚胎發生具有數量多、速度快、結構完整、再生率高等優點，并在很多領域中廣泛應用。人們對植物不定芽再生的機理及其應用方面做了大量的研究，在不同離體組織培養的養分需求，不同植物對環境因素、培養基成分、添加物質、植物激素的種類和濃度等各因素的需求，不同材料的不定芽增生和生長及不定芽發育機理等方面都得到了很大發展。本研究從植物再生過程中的生理生化角度進行綜述，幫助大家了解有關進展。

1 植物體細胞胚胎發生過程中的細胞生物學研究

細胞生物學研究體細胞胚發生過程是了解體胚發生過程的重要研究方法，主要通過石蠟切片技術、超微切片技術和組織化學染色研究方法探討體細胞胚胎發生過程中的形態學建成，觀察體細胞胚的發育過程，其中石蠟切片法最常見。目前關于植物體細胞胚胎發生過程的報道越來越多，普遍認為體細胞胚胎發生經歷球形胚或原胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚4個階段，但對體細胞胚胎發生的起源研究結果不盡一致，既有關于單細胞的報道，也有關于多細胞起源的報道。對植物體細胞胚胎發生的超微結構研究結果普遍顯示，在非胚性向胚性細胞的轉化過程中，胚性細胞形成厚壁，具有胞質濃、核大、液泡小、核仁大、細胞器豐富、線粒體數量增多、胞間連絲廣泛存在等特點。孫麗芳對玉米愈傷組織用石蠟切片組織觀察及電鏡掃描，結果顯示，胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織在細胞內部結構、愈傷組織外部形態和分化能力方面具有明顯差異，為以后研究奠定理論依據[1]。江榮翠對滇秋木體細胞采用掃描電鏡進行觀察，結果發現胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織具有明顯的形態特征[2]；張濤對蕓芥研究表明，能產生體細胞胚的胚性細胞具有核大、質濃、染色深、細胞排列緊密等特點，跟周圍的細胞有明顯的界限[3]。

2 抗氧化酶類

酶是植物生化反應的催化劑，在胚狀體發生過程中起非常關鍵的調節作用，所有需氧生物都必須依賴氧才能獲得能量和維持生命，然而當活性氧濃度超過正常水平時，對生物細胞會產生毒害作用[4-8]。有研究報道，生物體為了減輕和防止活性氧損傷，已形成了復雜的氧化反應機制，在植物組織培養的不同階段，這種抗氧化反應也是不斷變化的[9-14]。近年來，已有很多關于植物離體培養的研究，結果表明不定根、愈傷組織、不定芽等的形態發生都與過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性有關[15]。王亞馥等指出，在枸杞離體培養過程中，POD活性逐漸增強，整個變化過程中出現2個峰值，分別在分生細胞團芽的形成階段[16]。莊東紅等的研究結果表明，在組織培養過程中，大白菜子葉POD活性變化隨著外植體的分化、不定芽的產生呈增強趨勢[17]。崔凱榮等在研究枸杞體細胞胚發生過程中發現，隨著體細胞的發育，SOD、POD、CAT相互配合來調節胚性細胞的生長分化，這3種酶在枸杞胚胎發生與發育過程中都有不同的變化，變化情況與體細胞的伸長密切相關[18]。還有研究認為，體細胞胚發生與發育是大量酶特異性合成及參與代謝的結果，在細胞發育中可以穿透細胞膜，可以減少對細胞的損害，體細胞胚胎的發育與超氧化物自由基的清除密切相關[19-21]。許多植物的過氧化物酶活性在體胚發生過程中較強，詹園鳳等在大蒜體細胞胚胎發生過程中發現，SOD、POD、CAT活性變化與胚性愈傷組織的誘導及體胚的發育密切相關，POD對體胚的誘導起主導作用，而SOD和CAT在體胚的發育和成熟中起主導作用[22]。

3 生化物質的變化

在體細胞胚胎發生過程中，可溶性糖含量的變化可能為細胞分裂和發育提供物質和能量基礎，并可能預示著新的發育狀態即將開始。陳陸琴等將金蓮花、合歡莖尖接入分化培養基上后發現，莖尖基部形成愈傷組織，而后愈傷組織分化出不定芽，在培養基中培養的前12 d，可溶性糖含量迅速增加，伴隨著不定芽的生長，可溶性糖含量開始緩慢減少[23]。從啟動愈傷組織開始到形成愈傷組織過程中，可溶性糖含量較低；而從愈傷組織形成開始階段到愈傷組織分化形成不定芽的階段，可溶性糖含量較高，這可能是由于可溶性糖為形成不定芽的碳骨架原料，其含量提高可以保證愈傷組織的原料供應。當愈傷組織進行不定芽分化時，由于不定芽原基形成、生長，可溶性糖含量增多，直到器官分化完成后才開始逐漸減少，這也說明可溶性糖在不定芽發生過程中起的主要作用之一是提供碳源[24]。詹園鳳等在對大蒜體細胞胚胎發生過程進行研究時發現，可溶性糖含量在其細胞脫分化早期出現1次高峰，隨后迅速下降，在成熟期略有回升，由此得出可溶性糖在細胞脫分化早期出現累積高峰，細胞進入迅速分裂階段，此時可能為細胞進一步發育提供物質和能量基礎；可溶性糖含量在胚成熟期升高，這可能為新的發育階段提供物質和能量[22]。

辛偉杰發現，花燭體胚發生過程中可溶性蛋白質含量在球形胚和成熟胚2個時期出現峰值，而從誘導外植體形成胚性愈傷組織時，蛋白質含量降低；脫分化時，外植體細胞內蛋白質降解轉化成糖類及其他物質，為胚性細胞的形成提供能量，隨著胚性細胞進一步發育，細胞內積累了大量的蛋白質；成熟胚時期，可溶性蛋白質又大量積累，為后期的體胚萌發提供了物質保證[25]。齊力旺等發現，落葉松胚性愈傷組織中的游離氨基酸含量明顯低于非胚性愈傷組織，特別是游離基酸中的精氨酸含量，非胚性愈傷組織中精氨酸為胚性愈傷組織的 4 倍[26]。有報道指出，多胺能促進體細胞胚發生，而精氨酸為多胺合成的前體，其含量變化可能與多胺的合成及體細胞胚發生關系密切。

植物形態發生實質上受基因相互調控，是基因之間按時空順序表達的結果[27]。王亞馥等研究發現，在枸杞愈傷組織再分化形成不定芽時，上升的可溶性蛋白質含量為枸杞形態發生提供了必需的物質基礎[16]。已有大量研究結果表明，在植物體細胞胚胎發生過程中，可溶性蛋白質組分和含量發生改變，盡管有些結果不是很一致，但總的變化趨勢是相同的。不同物種中胚性愈傷組織的可溶性蛋白質合成速率和含量遠高于非胚性愈傷組織，可見前者代謝活性高于后者。

4 體胚發生中的特異蛋白

蛋白質是基因調控和表達的產物，植物體細胞胚胎發生是植物相關基因按一定時空表達順序而產生的結果。在體細胞胚胎發育的過程中，從外形、生理上可以分為幾個階段，即原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚、成熟胚以及再生成苗階段，植物離體再生中各個時期都必然會存在特異蛋白的表達。Marsoni 等成功地比較了葡萄胚性發生過程中形成的非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織蛋白表達差異，發現共有35 個蛋白點差異表達，且這些蛋白點可能與胚性發生有關[28]。這些蛋白既可作為調控因子，又可作為結構蛋白、酶蛋白和貯藏蛋白。孫麗芳利用蛋白質組技術檢測了玉米胚性發生相關蛋白的表達情況，共有 42 個蛋白點發生顯著變化，質譜成功鑒定 29 個蛋白點，根據蛋白功能將其分為細胞繁殖、翻譯與蛋白合成、脅迫響應、信號轉導等，因此對體細胞胚胎發生過程中特異蛋白的分析，對優化體胚發生機制、調控體細胞胚胎發生和體胚發生、發育的相關基因克隆與研究、遺傳轉化等工作具有重大意義[1]。

5 內源激素水平的變化

植物激素是植物體內天然存在的一系列有機化合物，作為執行細胞通信功能的化學信息，在代謝、生長、形態建成等植物生理活動的各個方面均起十分重要的體內信號傳導作用；植物體胚發生過程中的生理效應往往是多種激素間相互作用的結果，體胚發育時期不同，內源激素發生的變化不同。植物內源激素含量調控細胞分化和生長的方向與進程，以致于植物生命活動的整個過程，不同的植物種類和外植體都影響著內源因素的變化[29-30]。一些研究結果表明，植物愈傷組織的分化是內源生長素含量逐步降低的結果，也是細胞分裂素含量逐步升高的過程。劉滌等在研究煙草離體培養時發現，與未分化出芽的愈傷組織相比，已分化出芽的愈傷組織內源生長素含量明顯升高[31]；王秀紅等研究發現，在NAA和 6-BA 等2種激素作用下，水稻花藥、幼胚和花穗都可以誘導愈傷組織完成芽的形態分化，在內源NAA含量增高時，其愈傷出苗率逐漸下降，降低時愈傷出苗率逐漸增高，與內源細胞分裂素剛好相反，然而外源植物激素必須通過對內源激素平衡的調節才發生作用[32-33]。經研究發現，在NAA和6-BA作用下可以誘導水稻花藥、幼胚和花穗來源的愈傷組織完成芽的形態分化，其愈傷出苗率與內源生長素存在負效應，而與內源細胞分裂素存在正效應[34-35]。植株生長發育過程與植株內源和外源激素的種類、含量及配比等有密切的關系[36-38]；裴東等的研究結果表明，內源激素對菊花、水稻愈傷、紅富士蘋果、南瓜不定芽形成和分化起重要作用[39-41]；林士杰等在研究整個不定芽形成的過程中發現，內源激素ABA對不定芽的形成有利[42]；芽原基的啟動分化階段與較高濃度的ABA相伴隨，芽原基生長發育階段與高濃度的ABA相關，各種內源激素的代謝和動態平衡在細胞分化中起重要且關鍵的作用。

在植物體內，內部條件和外部培養條件相互作用，結果導致植物體內器官發生形態變化，內源激素的調控是重要因素之一，植物的外源激素須通過對內源激素的調節來控制器官的生長發育，各種植物生長物質的水平都通過影響植物外植體的基因表達而引起器官分化的。內源激素與受體或載體結合通過不同的信號轉導和傳遞方式來控制不同的生理功能，但其激素在分子水平上通過何種途徑來調控植物再生的作用機制仍有待深入研究。

6 問題與展望

總之，在植物組織培養過程中，植株再生途徑包括胚狀體發生，器官發生和體細胞發生，不同植物和同一植物不同組織或器官的再生途徑也不同，且植株再生受外植體生理狀態至關重要的影響，這些生理機制仍有待于進一步研究。這些變化是多方面的，由生理變化到內部基因的改變，都是相互作用的結果，這些隨著研究的不斷深入，分子生物學的蓬勃發展，這一科學問題必將會解決，植物再生的生理機制將在植物工廠化、 規模化生產中發揮重要的作用。

參考文獻：

[1]孫麗芳. 王米胚性組織相關克隆與功能驗證[D]. 長春：吉林農業大學，2012.[HJ1.2mm]

[2]江榮翠. 滇秋木體細胞胚胎發生及其機理研究[D]. 南京：南京林業大學，2010.

[3]張 濤. 蕓芥體細胞胚胎發生的組織細胞學研究[J]. 園藝學報，2007，34（1）：131-134.

[4]許煜泉，史益敏，尹協芬. 番茄離體子葉培養的形態發生及過氧化物酶的動態[J]. 上海農學院學報，1992，10（2）：121-126.

[5]張靜蘭，唐定臺，徐桂芳，等. 放線菌素D和環己亞胺對激素誘導綠豆子葉脫分化及其核酸、蛋白質代謝的作用[J]. 植物學報，1982，24（5）：433-439.

[6]戴均貴，周吉源. 華黃芪離體形態發生過程中生理生化特性變化的研究[J]. 華中師范大學學報：自然科學版，1997，31（2）：220-224 .

[7]屈姝存，劉選明，周樸華，等. 百合鱗片細胞形態發生中生理生化特性研究[J]. 生命科學研究，1998，2（4）：288-294.

[8] Meratan A A，Ghaffari S M，Niknam V. In vitro organogenesisand antioxidant enzymes activity in Acanthophyllum sordidum[J]. Biol Plant，2009，53：5-10.

[9]Batkova P，Pospisilova J，Synkova H. Production of reactive oxygen species and development of antioxidative systems during in vitro growth and ex vitro transfer[J]. Biologia Plantarum，2008，52（3）：413-422.

[10]Cui K R，Xing G S，Liu X M，et al. Effect of hydrogen peroxide on somatic embryogenesis of Lycium barbarum L.[J]. Plant Science，1999，146（1）：9-16.

[11]van Breusegem F，Vranová E，Dat J F，et al. The role of active oxygen species in plant signal transduction[J]. Plant Science，2001，161（3）：405-414.

[12]Papadakis A K，Siminis C I，Roubelakis-Angelakis K A. Reduced activity of antioxidant machinery is correlated with suppression of totipotency in plant protoplasts[J]. Plant Physiology，2001，126（1）：434-444.

[13]Tian M，Gu Q，Zhu M Y. The involvement of hydrogen peroxide and antioxidant enzymes in the process of shoot organogenesis of strawberry callus [J]. Plant Sci，2003，165（4）：701-707.

[14]Zhang S G，Han S Y，Wen H Y，et al. Changes in H2O2 content and antioxidant enzyme gene expression during the somatic embryo genesis of Larix leptolepis[J]. Plant Cell Tiss Org，2010，100：21-29.

[15]Abbasi B H，Khan M，Guo B，et al. Efficient regeneration and antioxidative enzyme activities in Brassica rapa var. turnip[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2011，105（3）：337-344.

[16]王亞馥，王侖山，丁惠賓. 枸杞組織培養中形態發生的細胞組織學觀察[J]. 蘭州大學學報，1989，25（4）：88-92.

[17]莊東紅，杜 虹. 大白菜子葉培養過程中POD同工酶和可溶性蛋白質含量的變化[J]. 汕頭大學學報：自然科學版，2002，17（1）：64-68，73.

[18]崔凱榮，任紅旭，邢更妹，等. 枸杞組織培養中抗氧化酶活性與體細胞胚發生相關性的研究[J]. 蘭州大學學報：自然科學版，1998，34（3）：93-99.

[19]Zhang B，Wang H Q，Wang P，et al. Involvement of nitric oxide synthase-dependent nitricoxide and exogenous nitric oxide in alleviating NaCl induced osmotic and oxidative stress in Arabidopsis thaliana[J]. Afr J Agr Res，2010，5（13）：1713-1721.

[20]Srivastav M，Kishor A，Dahuja A，et al. Effect of paclobutrazol and salinity on ion leakage，proline content and activities of antioxidant enzymes in mango（Mangifera indica L.）[J]. Sci Hortic，2010，125（4）：785-788.

[21]Zhao Y E. Cadmium accumulation and antioxidative defenses in leaves of Triticum aestivum L. and Zea mays L.[J]. African Journal of Biotechnology，2011，10（15）：2936-2943.

[22]詹園鳳，吳 震，金瀟瀟，等. 大蒜體細胞胚胎發生過程中抗氧化酶活性變化及某些生理特征[J]. 西北植物學報，2006，26（9）：1799-1802.

[23]陳陸琴，王關林，李洪艷，等. 彩萼石楠的組織培養和快速繁殖[J]. 植物生理學通訊，2005，41（1）：58.

[24] 張良波. 屋頂長生草離體培養及其形態發生的細胞學與生理生化變化的研究[D]. 長沙：湖南農業大學，2004.

[25]辛偉杰. 花燭體細胞胚胎發生及相關生理生化研究[D]. 南京：南京農業大學，2006：42-46.

[26]齊力旺，李 玲，韓一凡，等. 落葉松不同類型胚性和非胚性愈傷組織的生理生化差異[J]. 林業科學，2001，37（3）：20-29.

[27]Pan Z Y，Zhu S P，Guan R，et al. Identification of 2，4-D-responsive proteins in embryogenic callus of Valencia sweet orange （Citrus sinensis Osbeck） following osmotic stress[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2010，103（2）：145-153.

[28]Marsoni M，Bracale M，Espen L，et al. Proteomic analysis of somatic embryogenesis in Vitis vinifera[J]. Plant Cell Reports，2008，27（2）：347-356.

[29]Ali A，Ahmad T，Abbasi N A，et al. Effect of different concentrations of auxins on in vitro rooting of olive cultivar ‘Moraiolo[J]. Pakistan Journal of Botany，2009，41（3）：1223-1231.

[30]Feng J C，Yu X M，Shang X L，et al. Factors influencing efficiency of shoot regeneration in Ziziphus jujuba Mill.‘Huizao[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2010，101（1）：111-117.

[31]劉 滌，遲靜芬，劉桂蕓. 煙草愈傷組織器官發生過程中外源激素的作用[J]. 植物生理學報，1986，12（1）：104-108.

[32]王秀紅. 水稻不同外植體的組織培養能力及其內源激素分析[D]. 雅安：四川農業大學，2002.

[33]Leshem B. Polarity and responsive regions for regeneration in the cultured melon cotyledon[J]. Journal of Plant Physiology，1989，135（2）：237-239.

[34]Aida M，Ishida T，Fukaki H，et al. Genes involved in organ separation in Arabidopsis：an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J]. The Plant Cell，1997，9（6）：841-857.

[35]Aida M，Ishida T，Tasaka M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis：interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes[J]. Development，1999，126（8）：1563-1570.

[36]Centeno M L，Rodriguez A，Feito I，et al. Relationship between endogenous auxin and cytokinin levels and morphogenic responses in Actinidia deliciosa tissue cultures[J]. Plant Cell Reports，1996，16（1/2）：58-62.

[37]Valdés A E，Ordás R J，Fernández B，et al. Relationships between hormonal contents and the organogenic response in Pinus pinea cotyledons[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2001，39（5）：377-384.

[38]Wang X H，Shi X Y，Wu X J，et al. The influence of endogenous hormones on culture capability of different explants in rice[J]. Agric Sci China，2005，4（5）：343-347.

[39]裴 東，鄭均寶，凌艷榮，等. 紅富士蘋果試管培養中器官分化及其部分生理指標的研究[J]. 園藝學報，1997，24（3）：229-234.

[40]邵繼平. 聲波刺激對菊花愈傷組織內源激素IAA和ABA動態變化的實驗研究[D]. 重慶：重慶大學，2003.

[41]田春英，邵建柱，劉 瑩，等. 紅富士蘋果葉片不定芽再生中激素、多胺和NO含量的變化[J]. 園藝學報，2010，37（9）：1403-1408.

[42]林士杰，姜 靜，馮 昕，等. 黑林1號楊組培葉片不定根的發生與內、外源激素關系的研究[J]. 林業科技，2006，31（1）：8-11.