小型西瓜花藥愈傷組織誘導條件

王玉書　王歡　高美玲等

摘要：以2種基因型小型西瓜為試材進行花藥離體培養，研究西瓜花蕾橫徑、不同激素配比、低溫預處理、熱激處理對愈傷組織誘導的影響。結果表明，西瓜花蕾橫徑為4.6～5.0 mm時，誘導率最高，平均誘導率達到32.67%；2個西瓜品種的花藥在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L上誘導率均最高，分別為45.52%、30.50%；花蕾在4 ℃條件下低溫預處理48 h可以提高西瓜花藥愈傷組織的誘導率，誘導率達40.67%；將接種的花藥在33 ℃條件下進行 1 h 的熱激處理后，愈傷組織褐化率較高，不易長出綠色致密的愈傷組織。

關鍵詞：西瓜；花藥；愈傷組織；誘導

中圖分類號： Q943.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0030-03

小型西瓜又名迷你西瓜，果型小巧外形美觀，肉質鮮嫩多汁，瓜薄皮而少纖維，已成為一種高檔禮品。近年來，隨著人們生活水平的提高以及小型化家庭的發展，小型西瓜作為一種新興的西瓜優良新品種，市場發展前景十分廣闊，現已經成為高效農業項目之一[1]。目前，小西瓜品種主要依賴進口，種子價格很高，選育優良小型西瓜新品種是促進西瓜產業發展的重要因素[2]。采用常規育種手段選育新品種不僅耗時耗力、效率低，而且難以顯著提高新品種的產量、品質及抗性等。通過花藥培養獲得純系材料，是一種行之有效的育種途徑，既可以大大縮短育種時間，提高育種效率，節省人力和物力，同時也可為分子標記和基因研究提供材料基礎。薛光榮等研究，獲得西瓜花藥再生植株，但是愈傷組織的誘導率及分化率均較低，且重復性較差[3-4]。袁萬良等通過改良培養基將愈傷組織誘導率從0.5%提高到94.4%[5]。魏瑛研究表明，低溫預處理對西瓜花藥愈傷組織誘導有促進作用[6]。緱艷霞等在西瓜花藥離體培養影響因子研究中發現，適當添加激素以及4 ℃條件下低溫預處理也可提高愈傷組織的誘導率[7]。有關小型西瓜花藥培養至今未見相關報道。

本試驗研究了花藥橫徑大小、激素濃度組合、低溫預處理、熱激處理對西瓜花藥培養愈傷組織誘導的影響，旨在確定西瓜花藥培養的最佳條件，為西瓜花藥培養體系提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為齊齊哈爾園藝研究所西甜瓜研究室提供的2份小型西瓜種子，均為高代自交系，分別編號G1和G2。材料于 2014年 2 月初催芽播種，4 月初定植于溫室，于開花期取新鮮花蕾進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 取材和消毒

于西瓜盛花期晴天08：00—09：00，選擇健壯植株的花蕾，將G1花蕾按照橫徑不同分為4.0～4.5 mm、4.6～5.0 mm、5.1～5.5 mm 3組。首先將花蕾于70%的乙醇中表面消毒30 s，再用0.1% 的 HgCl2 浸泡 8 min，最后用無菌水沖洗 3次，每次 5 min。

1.2.2 激素處理

剝取G1和G2無菌花蕾的花藥接種于誘導培養基上。誘導培養基以MS為基本培養基（蔗糖40 g/L+瓊脂7.5 g/L），分別添加不同質量濃度的6-BA和NAA，共計9 個激素組合處理，以不添加任何激素的培養基為對照（表1）。利用愈傷組織誘導率最高的培養基進行后續試驗。

1.2.3 低溫處理

取供試材料G2花蕾120個，隨機分為4組，再用濕紗布包裹好，分別于4 ℃下預處理0、24、48、72 h，花蕾預處理完畢后，分別剝出花藥接種于“1.2.2”節篩選出的誘導培養基上進行培養，每瓶5枚花藥，每個處理接種6瓶。

1.2.4 熱激處理

采集G2大小一致的花蕾，剝取花藥接種于篩選出的誘導培養基后，先在33 ℃條件下12 h的熱激處理后再轉為25 ℃培養，以始終25 ℃培養為對照，各處理接種50枚花藥，共計10瓶。25 d后統計愈傷組織誘導率。

以上處理后均置于25 ℃黑暗條件下培養25 d后，統計愈傷組織誘導率。

愈傷組織誘導率=產生愈傷組織的花藥數量/接種的花藥數量×100%。

2 結果與分析

2.1 花蕾大小對愈傷組織誘導的影響

將大小不同花蕾的花藥于MS培養基后，置于25 ℃環境下暗培養25 d后，愈傷組織誘導率見表2。不同大小的花蕾其花藥愈傷組織的誘導率有顯著差異，橫徑在4.6～5.0 mm的花蕾誘導率最高，達36.00%，顯著高于其他組；其次是橫徑在5.1～5.5 mm的，為24.00%，最低的是橫徑在4.0～4.5 mm 的，僅為18.00%。橫徑為4.6～5.0 mm時，外植體的褐變率顯著低于其他2組。本試驗中西瓜花蕾直徑處于4.6～5.0 mm時，花藥愈傷組織的誘導效果最好。

2.2 不同激素配比對花藥愈傷組織誘導的影響

2種基因型材料在9種激素組合的培養基中都能誘導出愈傷組織（表3），且愈傷組織誘導率存在一定的差異，2種基因型材料都在M2 （MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L）培養基中愈傷組織誘導率較高，分別達到了4552%和3050%；并且M2號培養基誘導的愈傷質量最好，外植體褐化率也較低。在試驗中還觀察到，不同花藥形成愈傷組織形態特征不同，一種愈傷組織質地疏松，呈綠色或者白色；另一種愈傷組織質地緊密、色嫩綠，有光澤，愈傷組織多由花藥頂端及中部由里及外生長。當NAA激素超過1.0 mg/L時，生成的愈傷組織比較疏松白化，培養時外植體容易褐化死亡，當NAA濃度為1.0 mg/L、6-BA濃度為1.5 mg/L時形成的愈傷組織質地致密，色澤亮綠，質量較好。

2.3 低溫處理時間對花藥愈傷組織誘導的影響

利用M2培養基對G2花藥進行培養，研究不同低溫處理時間對花藥誘導率的影響（圖1）。當低溫處理時間為48 h時，花藥愈傷組織的誘導率最高，達40.67%，處理時間為 24 h 時，誘導率達35.00%，當預處理時間延長至72 h時，誘導率僅有32.33%，但均高于對照21.00%的誘導率。

2.4 熱激處理對西瓜花藥愈傷組織誘導的影響

將G2花藥接種在M2培養基上，將部分培養基于33 ℃下進行12 h的熱激處理，之后置于25 ℃的環境下培養，花藥愈傷組織誘導率結果見表4。進行熱激處理的花藥愈傷組織誘導率顯著低于未經處理的對照，花藥褐化率也明顯高于未進行熱激處理的。

3 討論

花粉發育階段對誘導雄性單性生殖至關重要，是能否誘導成功及誘導頻率高低的內在因素之一，關系到是否能產生胚性愈傷組織，進而也關系到培養效果。在大多數作物花藥培養中，花粉發育時期選用的都是單核靠邊期[8]。但在試驗中對每個花蕾進行鏡檢過于麻煩，如果找到適宜誘導愈傷組織形成的花蕾大小，可讓培養過程更加簡單。本試驗中將花蕾按照橫徑不同分為4.0～4.5 mm、4.6～5.0 mm、5.1～5.5 mm 3組，分別進行誘導，誘導結果橫徑在4.6～5.0 mm的花蕾誘導率最高，達36.00%，顯著高于其他組，在后期試驗中可以根據花蕾橫徑進行挑選試材。

不同培養基對植物花藥的培養效果不同。王玉英等在甜椒花藥培養中對N6、MS、NTH 3種培養基的培養效果進行了對比，結果發現MS和NTH培養基既能很好地產生愈傷組織，也能形成胚狀體[9]。陳肖師將MS、H、B5、Nitsch和NTH 5種培養基的誘導率進行了比較，發現MS培養基的效果最好[10]。本試驗中以MS為基本培養基，在試驗中發現2個基因型材料在9種激素組合的培養基上都能誘導出愈傷組織，但是不同激素組合誘導頻率存在一定的差異。G1基因型花藥愈傷組織誘導率總體要高于G2基因型，但是M2培養基（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L）上2個基因型的愈傷組織誘導頻率均最高而且質量最好，外植體褐化率也較低。后期試驗中就可以在MS基本培養基中添加上述激素濃度進行誘導。

誘導花藥形成愈傷組織的質量受低溫預處理的時間長短影響[11-12]。Sunderland認為，低溫作用機理不在于改變紡錘體的軸向，而在于使花粉保持生活力，使其不在數天內死亡[13]。徐武等推測低溫處理作用是改變了花藥中內源激素的含量，阻斷了花粉正常發育途徑，使其由配子體發育途徑向孢子體發育途徑轉變[14]。黃斌也認為，低溫致使花藥內源激素發生變化，進而愈傷組織形成；低溫處理使花藥的壁細胞及絨氈層逐漸解體，導致小孢子孤立化，使絕大部分小孢子保持其生活力[15]。基于以上研究，本試驗對花藥進行了不同時間的低溫預處理，結果表明，低溫處理 48 h時，花藥愈傷組織的誘導率最高，達40.67%，其次是處理時間為24 h時，誘導率達3000%，最低的是處理72 h，僅有32.33%，但均高于對照處理21.00%的誘導率。表明適宜的低溫預處理可以提高花藥愈傷組織的誘導率。

組織褐變的主要原因是由多酚氧化酶催化多酚類物質氧化生成褐色物質所致，褐變與多酚氧化酶的活性及酚類物質的含量密切相關[16]。夏銘等采用45 ℃處理紅豆杉外植體，發現熱激處理對克服褐變是有效的[17]。Martin等研究認為熱激處理抑制了多酚氧化酶的合成[18]。本試驗結果與以上研究結果相反，前期熱激處理的花藥愈傷組織誘導率明顯偏低，而且褐化率高于未進行熱激處理的花藥。本結果與 Fukumoto 等在冰山萵苣組織培養中的研究結果[19]一致。

參考文獻：

[1]徐滿君，蔣有條. 小西瓜的生育特性及其栽培技術[J]. 浙江農業科學，2000（6）：294-296.

[2]李步勛，陶抵輝，阮萬輝. 西瓜離體組織細胞染色體加倍技術的研究和應用[J]. 陜西農業科學，1999（3）：22-24.

[3]薛光榮，余文炎，費開偉，等. 西瓜花藥離體培養獲得花粉植株[J]. 植物生理學通訊，1983（4）：40-42.

[4]薛光榮，余文炎，楊振英，等. 西瓜花粉植株的誘導及其后代初步觀察[J]. 遺傳，1988，10（2）：5-8，49.

[5]袁萬良，付潤民，雷保林，等. 西瓜花培試驗初報[J]. 陜西農業科學，1995（1）：29-30.

[6]魏 瑛. 低溫預處理對西瓜花藥誘導愈傷組織的影響[J]. 甘肅農業科技，1999（9）：3.

[7]緱艷霞，張明方. 西瓜花藥離體培養影響因子研究[J]. 北方園藝，2013（10）：117-120.

[8]李 娟，張 麗，李煥秀，等. 西瓜花藥培養技術研究[J]. 中國瓜菜，2008，21（4）：8-10.

[9]王玉英，郭仲琛，李春玲，等. 甜椒花藥培養的初步研究[J]. 園藝學報，1980（1）：33-38，65.

[10]陳肖師. 甜椒花藥培養及‘塞花一號的育成[J]. 中國蔬菜，1988（3）：5-7.

[11]段 青，吳麗芳，李金澤，等. 洋桔梗花藥培養的影響因素[J]. 江蘇農業科學，2013，41（9）：28-31.

[12]陳永勝，邵志敏，李國瑞，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導及防褐化研究[J]，江蘇農業科學，2014，42（3）：39-40.

[13]Sunderland N. Anther culture as a means of haploid production[M]//Kasha K J. Haploids in higher plant：advances and potential. Guelph，Canada：University of Guelph，1974：91-122.

[14]徐 武，李 鳴，張 敬，等. 低溫預處理過程中大麥花藥內源激素的變化[J]. 遺傳學報，1997，24（2）：67-71.

[15]黃 斌. 大麥花藥培養中低溫預處理對花粉愈傷組織形成的影響[J]. 植物學報，1985，27（4）：439-443.

[16]崔堂兵，郭 勇，張長遠. 植物組織培養中褐變現象的產生機理及克服方法[J]. 廣東農業科學，2001（3）：16-18.

[17]夏 銘，吳絳云，張麗梅. 紅豆杉組織培養中褐變問題的研究[J]. 生物技術，1996，6（3）：18-20.

[18]Martin-Diana A B，Rico D，Barry-Ryan C，et al. Effect of heat shock on browning-related enzymes in minimally processed Iceberg lettuce and crude extracts[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2005，69（9）：1677-1685.

[19]Fukumoto L R. Toivonen P M A，Delaquis P J. Effect of wash water temperature and chlorination on phenolic metabolism and browning of stored iceberg lettuce photosynthetic and vascular tissues[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（16）：4503-4511.