互葉白千層的快繁技術

殷勤　杜尚廣　張青等

摘要：為研究出一套完整的互葉白千層快繁技術體系，以互葉白千層幼苗莖段為外植體，分別以誘導率、增殖倍數、生根率為指標，采用正交試驗對芽誘導培養基、叢生芽增殖培養基、生根培養基進行優化。結果表明，最佳誘導培養基為MS+ 0.01%活性炭+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，誘導率為82.8%；最佳增殖培養基為MS+30 g/L蔗糖+0.25 mg/L 6-BA，增殖倍數為31倍；最佳生根培養基為1/2 MS+30 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA，生根率達100%，移栽30 d后成活率達80%以上。研究結果為互葉白千層的工廠化育苗提供了技術參考。

關鍵詞：互葉白千層；快速繁殖；正交試驗；芽誘導；叢生芽增殖；生根

中圖分類號： Q945.51 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0020-04

互葉白千層（Melaleuca alternifolia）為桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬 （Melateuca）常綠小喬木，原產于澳大利亞的新南威爾士州和新西蘭的部分地區[1]，是近年我國成功引進的高價值經濟植物及綠化樹種。互葉白千層對污染物有很強的凈化能力[2-4]，可用于構建植物浮床[5]。互葉白千層的新鮮枝葉和樹干提取的精油俗稱茶樹油，可以高效、無毒、無刺激地殺死人體皮膚表面的真菌和細菌[6-9]，并對某些病毒也有抑制作用[10-11]，是一種強效的抗菌劑[12-17]、殺蟲劑[18-20]、芳香劑[21]、防腐劑[22]，是不可多得的天然保健醫藥材料，廣泛應用于制藥、日化、食品、香料等行業。因此，種植互葉白千層具有巨大的生態和經濟效益。

目前，國內外對互葉白千層的研究主要集中在其精油的提取、成分分析及作用等方面[23-24]，而對利用組織培養技術進行再生植株的研究較少，目前尚沒有完整的快繁技術體系。依據精油化學成分含量的不同，互葉白千層分為6種[25]，其中僅松油醇-4型優良品種提取的精油成分滿足國際標準[26]。為獲得品種優良的互葉白千層，使用種子繁殖多敗育，發芽率很低[27]，且后代易產生變異，難以保持親本優良性狀；扦插繁殖生根率雖高[28]，但成活率較低[29]。組織培養既可以保持親本的優良性狀，又可以將獲得的優良株系快速推廣應用于生產，有望成為互葉白千層產業化育苗的主要繁殖手段。

本試驗以互葉白千層莖段為材料，進行表面滅菌處理，對誘導培養基、增殖培養基、生根培養基進行篩選，并對試管苗馴化移栽，擬建立一套完整的互葉白千層快繁技術體系，為互葉白千層的優株選育提供理論依據，為其工廠化育苗提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

互葉白千層為溫室栽培植株，株高20 cm，由江西撫州市森源生物科技有限公司提供。

1.2 儀器

W-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司生產），LMQJ型立式滅菌鍋（山東新華醫療器械股份有限公司生產），JY2002電子分析天平（精密科學儀器有限公司生產），JA1003N電子天平（精密科學儀器有限公司生產）。

1.3 方法

1.3.1 外植體的表面滅菌及預處理 培養60 d的溫室種植的互葉白千層幼苗，株高30 cm，在20 cm處去頂。30 d后，隨機剪取5 cm的幼苗莖段，剪去部分葉片，用洗衣粉液浸泡30 min，流水沖洗2 h；70%乙醇處理30 s，無菌水洗3次，然后用 0.1% HgCl2處理3 min，無菌水洗4次，待用；去掉莖段頂部，剪取約1 cm、含4～5個節點的莖段，接種到誘導培養基中。為了降低酚類物質氧化褐變引起的生長抑制，在第3 天將莖段轉接到新的培養基中。

1.3.2 誘導培養基的優化 采用3因素4水平L16（43）正交試驗。各因素水平見表1。共16組固體培養基，每組8瓶，每瓶5個莖段；30 d后統計長芽的外植體數、芽數，并計算誘導率。誘導率的計算公式如下：

誘導率=誘導出芽的外植體數÷接種的外植體數×100%。

1.3.3 增殖培養基的優化 采用3因素4水平L16（43）正交試驗。各因素水平見表2。共16組液體培養基，每組16瓶，每瓶5個誘導出單芽的莖段；60 d后統計叢生芽數，并計算增殖倍數。增殖倍數的計算公式如下：

增殖倍數=叢生芽數÷接種的外植體數×100%。

1.3.4 生根培養基的優化 采用4因素3水平L9（34）正交試驗。各因素水平見表3。共9組固體培養基，每組10瓶，每瓶5個幼枝莖段；30 d后統計生根的外植體數，并計算生根率。生根率的計算公式如下：

生根率=生根的外植體數÷接種的外植體數×100%。

1.3.5 移栽 生根培養30 d后，將試管苗轉移到室外煉苗，散射光光照培養10～20 d，當組培苗抽高生長，木質化程度加強時，即可移栽。取出試管苗，清洗根部，再用0.1%高錳酸鉀溶液消毒30 s，自來水清洗除去殘留的高錳酸鉀，然后把試管苗移栽至含基質（泥炭 ∶[KG-*3]珍珠巖=1 ∶[KG-*3]1）的花盆里，遮陽網遮陽，將1 L的塑料飲料容器底部剪掉，罩在試管苗上，保持幼苗周圍濕潤。14 d后，遮陽網部分移除，容器一側抬起以露出植物。再過7 d后，遮陽網移除，移走容器。移栽30 d后統計成活率。

1.4 培養條件

溫度（25±2） ℃，光照12 h/d，光照強度2 500～3 000 lx。誘導培養基、增殖培養基和生根培養基的基礎培養基均為MS培養基，通過添加各種不同濃度的激素或蔗糖、MS成分減半進行優化；固體培養基中加7.0 g/L瓊脂，調pH值為5.8；液體培養基不加瓊脂，不調節pH值，實際測得pH值為5.2。

2 結果與分析

2.1 誘導培養基的優化

互葉白千層莖段在誘導培養基上培養30 d，統計結果見表4。極差分析表明，3個因素對互葉白千層芽誘導的影響大小依次為：NAA>活性炭6-BA。隨著NAA濃度的增加，誘導率呈下降趨勢；當活性炭濃度為0.01%、6-BA濃度為 0.1 mg/L、NAA 濃度為0.05 mg/L時，誘導出芽數是2.46個，誘導率是82.8%。方差分析表明，3個因素對誘導率及芽數無顯著影響（表5、表6）。

芽誘導主要是已有芽原基在解除頂端優勢之后的萌發。本試驗結果表明，不同培養基對外植體的誘導率及芽數無顯著影響，最佳誘導效果的培養基為：MS+0.01%活性炭+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。

2.2 增殖培養基的優化

互葉白千層芽誘導后在液體培養基中增殖培養60 d，增殖倍數的統計結果見表7。極差分析表明，3個因素對互葉白千層芽增殖的影響大小依次為：NAA>6-BA>蔗糖。隨著NAA濃度的增加，增殖倍數呈下降趨勢，當NAA濃度為0時增殖倍數最高。隨著6-BA濃度的增加，增殖倍數先增大后減小，當6-BA濃度達0.250 mg/L時增殖倍數最高，這可能是由于低濃度的6-BA促進細胞分裂，而高濃度的6-BA則抑制細胞分裂。隨著蔗糖濃度的增加，增殖倍數先增大后減小，當蔗糖濃度達30 g/L時，增殖倍數最高。方差分析表明（表8），NAA對增殖倍數影響達顯著水平（P<0.05）。互葉白千層芽增殖的最佳培養基組合為：MS+30 g/L蔗糖+ 025 mg/L 6-BA，增殖倍數達31倍。

List等采用單因素試驗獲得的增殖培養基為MS固體培養基+1.0 mg/L BA，培養時間為63 d，增殖倍數為5.5倍[30]。De Oliveira等同樣用單因素試驗獲得的增殖培養基為MS液體培養基+0.25 mg/L BA，培養時間為56 d，增殖倍數為118倍[31]。樊吉尤等用不同激素組合進行試驗，結果表明較好的激素組合是0.8 mg/L 6-BA+0.01 mg/L 2，4-D，增殖倍數為14.88倍[32]。本研究通過正交試驗，獲得了最佳的增殖培養基，增殖倍數達31倍，而且叢生芽較粗壯，呈深綠色（圖1-C），結果顯著好于已往報道。主要原因有：（1）互葉白千層通常生長在沼澤中[33]，喜酸性或微酸性土壤[34-35]，本試驗使用的液體培養基，pH值為5.2，適合其生長；（2）以往研究一般在培養基中僅添加NAA，本試驗將其設定為因素之一，結果表明，NAA與增殖倍數呈負相關，不加NAA的第6處理的培養基效果最佳；（3）本試驗使用的是液體培養基，養分交換非常充分，營養物質可以更好地被吸收[31]。

由表7可知，第8處理的培養基中外植體的增殖倍數為0，觀察發現該組培養基中的外植體無明顯生長，逐漸變成褐色，可能原因是激素配比不利于芽的生長，同時液體培養基中氧氣含量比較低，外植體易發生缺氧壞死。

2.3 生根培養基的優化

生根培養30 d后，生根率統計結果見表9。極差分析表明，對互葉白千層生根率的影響大小依次是：NAA>基本培養基=IAA>蔗糖。由表9可知，所有培養基的生根率都在80%以上，第6處理的生根率和根系發達程度最高。觀察可知，該處理試管苗根系發達，有3級根，一級根上生成粗細不同的二級根，并且在粗二級根上形成三級根，各級根上均有少量根毛；在以后煉苗時發現，這樣的根系更加有利于移栽成活。因此，最佳生根培養基是含30 g/L蔗糖、0.1 mg/L NAA和 0 mg/L IAA的1/2MS培養基。

2.4 移栽

幼苗移栽是試管苗從實驗室適宜生長環境到復雜外界環境，并發生從異養到自養的轉變過程。因此，移栽前要進行煉苗，讓試管苗更好地適應自然環境。在本試驗中，經過煉苗，幼苗的地上、地下部分均具有較強木質化，移栽成活率達80%以上；其中，莖部粗壯、葉片濃綠、根系發達的幼苗，移栽時更易成活。

3 結論

通過正交試驗得出互葉白千層外植體的最佳誘導培養基為MS+0.01%AC +0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，誘導率達82.8%；最佳增殖培養基為MS+30 g/L蔗糖+0.25 mg/L 6-BA，增殖倍數達31倍；最佳生根培養基為 1/2 MS+30 g/L 蔗糖+ 0.1 mg/L NAA，生根率達100%；移栽 30 d 后，成活率達80%以上。研究結果為互葉白千層的工廠化育苗提供了科學依據。

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