雪蓮果葉腐病病原菌鑒定及生物學特性

涂勇

摘要：從雪蓮果葉片的病斑上分離得到一種病原真菌，根據病害癥狀特點、病菌形態特征和培養性狀等進行鑒定，確定其為鏈格孢屬（Alternaria spp.）真菌。設置不同的培養基、pH值、溫度、濕度及光照對葉腐病菌進行生物學特性研究，結果表明，該菌最適生長培養基為PDA培養基，最佳pH值為7.0，最適生長溫度為 26 ℃，最適生長濕度為65%，光照對其影響不大。

關鍵詞：雪蓮果；葉腐病；鏈格孢；鑒定；生物學特性

中圖分類號： S432.4+4 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0121-03

雪蓮果，屬菊科葵花屬植物，含有酚酸、黃酮、酯類、揮發油、多糖等成分，清肝解毒、清理腸胃、排毒通便、養顏美容，并有降血糖、降血脂、抑菌、促進鐵鈣吸收等藥理作用，特別適合糖尿病人和減肥者食用[1-2]。近年來通過多種途徑進入我國，目前已在云南、福建、貴州等地引種栽培成功[3-4]。然而，雪蓮果自傳入我國這十余年來，其相關理論和技術研究較少，尤其對種植過程中病蟲害的發生情況及其防治措施未見深入研究及報道，這顯然與近年來其發展趨勢是相矛盾的。同時，近年來由于雪蓮果在四川攀西地區的大面積連年種植以及氣候變化等原因，雪蓮果種植的各個時期葉腐病、鐮刀葉斑病、褐斑病、紫斑病等葉部病害發生較為嚴重，且有逐年加重的趨勢，對其生產帶來了較大的危害，但國內外學者對雪蓮果葉部病害尤其是葉腐病進行系統研究的資料甚少，這顯然已不適應當前雪蓮果產業的發展要求[5]。由此可知，研究雪蓮果葉腐病的發生、發展規律及防治措施對雪蓮果產業的發展具有重大的理論和現實意義。鑒于此，本研究在攀西地區特定條件下，對雪蓮果葉腐病進行了病原菌鑒定和生物學特性研究，為雪蓮果種植及病害的防治提供一定的理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離、純化及鑒定

1.1.1 樣本采集及病原菌分離

病害樣本采集于西昌學院農業科學學院試驗田（該試驗田雪蓮果種植的整個時期均未施用任何化學農藥），對葉部（葉面、葉緣、葉尖）病害進行癥狀觀察和記錄并帶回實驗室供室內試驗。參照《植病研究方法》中病原真菌的組織分離法[6]對葉片上的病原菌進行分離、純化，并經單孢分離獲得純培養菌株。

1.1.2 病原菌形態特征觀察與鑒定 將菌株移于PDA平板上，置于22 ℃的恒溫培養箱中培養，逐日觀察記錄病原菌的培養性狀。經過PDA培養純化后，挑取所得的純菌株制片，并在顯微鏡下觀察病原菌孢子的形態特征。根據以上性狀并查閱相關文獻，初步判定病原菌的種類。

1.1.3 病原菌的科赫氏法則鑒定 用所得的菌株配成孢子懸浮液，采用刺傷和無傷接種法[7-8]，把孢子液涂于雪蓮果的健康葉片上，以無菌水涂抹葉片保濕作對照，然后將接種的雪蓮果葉片放入具有濕潤無菌紙的培養皿中，置于22 ℃的恒溫培養箱內保濕培養。每處理重復3次，觀察和記錄接種結果，比較其發病癥狀是否與初次分離時的癥狀一致，并對接種成功的病斑再次進行組織分離，確認致病菌株。

1.2 雪蓮果葉腐病病原菌生物學特性研究

處理的設置分別如下：選擇燕麥培養基、PDA、PSA、玉米培養基和牛肉膏蛋白胨培養基共5種不同培養基進行雪蓮果葉腐病病原菌最佳培養基篩選試驗，其最優結果作為其他試驗所采用的培養基；病菌最適培養pH值試驗分別設置pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的6個pH值梯度，篩選得到的最佳pH值作為后續試驗的基礎條件；病菌適宜培養溫度試驗設置18、20、22、24、26、28、30 ℃共7個溫度梯度，所得出的最佳溫度作為后續試驗培養該菌的基本溫度；病菌最佳培養濕度試驗設置35%、50%、65%、75%、79.8%和88%共6個梯度；光照對菌落生長的影響試驗設全黑暗、半光照（日光燈照射12 h光暗交替）和全光照3個處理。以上各試驗每處理均做3次重復。

將活化的菌種用打孔器打成直徑為0.4 cm的菌餅，分別接種后放到不同試驗條件下培養，采用“十”字交叉法逐日測量菌落直徑并觀察生長情況。

將各項試驗記錄數據分別錄入相應的數據文件，用Microsoft Excel和SigmaPlot 10.0軟件計算各處理的平均值和標準差，并進行統計分析比較和作圖。

2 結果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 病原菌癥狀描述

該病危害雪蓮果葉片，初期病部為淡黃色圓形或不規則小點，無明顯暈圈，后期病斑沿葉脈呈條形散射狀擴大，繼而連成一片，天氣潮濕時葉片腐爛，其上產生大量黑褐色霉層（圖1）。

2.1.2 病原菌的培養性狀及形態特征

病原菌在PDA培養基上菌落呈絨毛狀，不規則圓形，菌絲初期呈灰白色至灰褐色，后期菌落表面顏色有明顯分層現象，菌落中間灰黑色，邊緣灰白色；接種1～2 d內氣生菌絲以垂直生長為主，菌落隆起高度可達1 cm，接種3 d后菌絲橫向生長速度加快，接種 6 d 后菌絲成熟，其頂端出現黑色小粒點，開始產孢（圖2）。菌絲直徑0.82～2.87（平均1.63） μm，早期菌絲無隔，后期逐漸產生隔膜；無性孢子為分生孢子，孢子有隔，單生或串生呈球形、卵形至長圓形，大小在7.12～13.79（平均9.72） μm×1.98～7.54（平均4.57） μm范圍內；節間產生小格孢，成不規則的灰黑色四邊形，格孢大小為3.30～14.41（平均9.88） μm×1.83～8.22（平均494） μm（圖3）。

2.1.3 科赫氏法則證病

把從發病部位分離獲得的病原菌菌株回接到健康無病的雪蓮果葉片上，刺傷接種的葉片5 d后開始發病，無傷接種的葉片10 d后開始發病。無論是刺傷接種還是無傷接種，其癥狀特點與自然發病葉片相同，清水對照不發病。從接種的病組織分離的病原菌與自然發病組織分離的病原菌形態一致。

根據病原菌癥狀特點、形態特征、培養性狀及科赫氏證病結果，并參考相關文獻，確定從該地區雪蓮果葉片上分離得到的病原菌為鏈格孢屬（Alternaria spp.）真菌。

2.2 雪蓮果葉腐病病原菌生物學特性研究

2.2.1 不同培養基對雪蓮果葉腐病菌菌絲生長情況的影響 經活化后的雪蓮果葉腐病菌在5種培養基中均可正常生長，各菌落生長的平均直徑大小不一（圖4）。在PDA、PSA培養基中生長無顯著性差異，它們與其他培養基上的菌落平均直徑呈極顯著差異（P<0.01），在玉米培養基中生長最慢。在5種培養基上菌株的直徑大小依次為：PDA>PSA>燕麥>牛肉膏蛋白胨>玉米培養基。其中，菌株被培養96 h時菌落直徑在PDA培養基中優先達到最大，達7.13 cm，且菌絲灰白、濃密，整齊度高。因此，PDA培養基是雪蓮果葉腐病菌生長的最佳培養基，并且在接下來的pH值、溫度、濕度和光照條件的試驗中均采用該培養基作為該菌的基礎培養基。

2.2.2 不同pH值對雪蓮果葉腐病菌菌絲生長情況的影響 將經活化后的雪蓮果葉腐病菌接種到不同pH值的PDA培養基上，菌株在pH值為4.0～9.0范圍內均能生長。pH值為4.0～7.0范圍內菌株的菌落平均直徑隨pH值增加而增加；pH值為 80～9.0 時，菌落平均直徑隨pH值升高而減小 （圖5）。菌株在pH值為4.0時生長最慢，培養7 d時其菌落平均直徑僅為2.8 cm；在pH值為7.0的培養基中生長良好，培養7 d時其平均菌落直徑達到7.17 cm，與其他各處理間差異達到極顯著水平（P<0.01）。因此，通過該試驗可以得出雪蓮果葉腐病菌的最適宜生長pH值為7.0。因此，在接下來的溫度、濕度和光照條件的試驗中均采用該pH值條件為其基本培養條件。

2.2.3 不同溫度對雪蓮果葉腐病菌菌絲生長情況的影響 圖6表明，各種溫度下菌落平均直徑有明顯的差異，溫度是影響菌株生長的重要因子。菌株在18～30 ℃都能生長，但生長的適溫范圍是24～26 ℃，以26 ℃最佳，在此溫度下培養的菌落生長最快且菌絲濃密整齊，培養7 d時平均菌落直徑達到6.97 cm，與其他各處理間差異極顯著（P<0.01）。當培養溫度為18 ℃和30 ℃時菌絲生長受到抑制，培養7 d時其菌落平均直徑最小，分別僅為2.77 cm和2.97 cm， 與其他處理呈極顯著差異。以上結果說明，雪蓮果葉腐病菌生長的最適溫度為26 ℃，溫度過高或過低均不利于該菌株生長。因此，在接下來的濕度和光照條件試驗中均采用該溫度條件為該菌的基本生長條件。

2.2.4 不同濕度對雪蓮果葉腐病菌菌絲生長情況的影響 將在pH值為7.0的PDA培養基上以26 ℃恒溫培養的雪蓮果葉腐病菌在不同濕度條件下進行培養，菌株的生長情況如圖7所示。該菌在供試濕度范圍35%～88%內均可生長，在濕度為50%～75%時生長較快，以65%最佳，此條件下培養的菌落生長最快，培養7 d時其平均菌落直徑高達7.10 cm，與其他濕度條件的處理差異極顯著（P<0.01），而當濕度為88%和35%時菌絲生長受到抑制，其菌落直徑最小。通過該試驗可以得出雪蓮果葉腐病菌的最適宜生長濕度為65%，并將其作為光照條件試驗的濕度條件。

2.2.5 不同光照條件對雪蓮果葉腐病菌菌絲生長的影響 將經活化后的雪蓮果葉腐病菌菌絲塊接種到pH值為7.0的PDA培養基上，在溫度26 ℃、濕度為65%條件下置于不同光照環境中培養，該菌株均能夠正常生長，在全光照、半光照、全黑暗的生長條件下菌落的生長直徑之間沒有顯著性差異，不同的光照條件對雪蓮果葉腐病菌的生長影響不大（圖8）。

3 結論與討論

通過對雪蓮果葉腐病癥狀的觀察、病原菌的分離培養以及病原菌的鑒定，確定雪蓮果葉腐病病原菌為鏈格孢屬（Alternari spp.）真菌。

病原菌生物學特性試驗中分別研究了不同培養基、pH值、溫度、濕度和光照條件對雪蓮果葉腐病菌生長情況的影響，采用只允許一個變量發生變化，而其他量不變的單因素試驗方法，通過分步驟試驗，并進行單因素方差分析找出相應的顯著性關系，最后依次找出最佳試驗因子。結果表明，雪蓮果葉腐病菌的最適生長培養基為PDA培養基，最佳pH值為7.0，最適生長溫度為26 ℃，最適生長濕度為65%，光照對其影響不大。這些結果與王仕玉等對齒瓣石斛病原鏈格孢菌（Alternaria tenuis）和王春江等對小麥鏈格孢（Alternaria triticina）的生物學特性研究的結果[9-10]基本相近，僅在對pH值變化的反應方面存在一定的差異。這可能是由于菌株在不同的地域及寄主植物上產生不同的寄生適應性，而這些適應性導致其在某些生物學特性上可能顯示出一定的差別。

本研究明確了雪蓮果葉腐病的致病病原菌及該菌的主要生物學特性，為進一步研究該菌奠定了基礎，對于有效控制該病提供了重要的參考價值。

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