多倍體誘導和60Coγ射線輻射對彩色馬蹄蓮Parfait分子水平遺傳變異的影響

鄭玉紅　張智　陸波等

摘要：采用RAPD分子標記，對彩色馬蹄蓮Parfait（Pr）及其秋水仙素誘導的四倍體（Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的變異進行研究。從40個寡聚核苷酸引物種篩選出14個合適的引物進行擴增，5個樣品共擴增出位點90個，平均每個引物擴增出6.29個位點；其中，多態性位點39個，多態性位點的比率為43.33%。此外，還觀察到的等位基因數（na）為1.4021個，有效等位基因數（ne）為1.2965個，Neis基因多樣性（h）為0.166 6，Shannons多樣性指數（I）為0.242 1。可見，多倍體誘導和輻射誘變使彩色馬蹄蓮Parfait在分子水平產生了一定的變異，豐富了彩色馬蹄蓮遺傳多樣性。通過聚類分析將5個樣品可分為2支，其中Pr、Pr-2和Pr-d聚為一支，Pr-1和Pr-4聚為一支。

關鍵詞：多倍體；誘導；彩色馬蹄蓮；RAPD；遺傳相似性；聚類分析；抗病育種；分子生物學

中圖分類號： S335.21；S682.2+64.03 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0142-02

彩色馬蹄蓮（Zantedeschia hybrida）為天南星科（Araceae）馬蹄蓮屬（Zantedeschia）多年生草本植物，原產于南非[1]。自20世紀80年代末引入我國以來，彩色馬蹄蓮以其花色絢爛、花形高雅、觀花期長而深受消費者的喜愛，因此被稱為21世紀的“明星花卉”。彩色馬蹄蓮在栽培過程中最嚴重的病害是軟腐病[2]，其在引種到我國長江中下游地區后受高溫高濕的影響，軟腐病病害問題更加突出，培育抗軟腐病的彩色馬蹄蓮品種是解決這一問題的有效途徑。但彩色馬蹄蓮所有品種對該病的抗性均比較弱；而且目前彩色馬蹄蓮新品種培育方式以雜交育種為主。很顯然，這種育種方式很難培育出抗病的彩色馬蹄蓮品種。所以，研究人員探索采用物理或化學誘變的方式提高彩色馬蹄蓮的抗病性，從而培育抗病的彩色馬蹄蓮品種。本試驗采用RAPD分子標記技術對彩色馬蹄蓮品種Parfait（編號為Pr）及其秋水仙素誘導的四倍體（編號為Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（分別編號為Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的變異和差異進行研究，為彩色馬蹄蓮抗病新品種的培育提供分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料為2002年引種自荷蘭的彩色馬蹄蓮品種Parfait，其佛焰苞粉紅色（上紅下白），葉片盾劍形，上有斑點，引種后在本地的適應性良好。除Parfait外，還有經20、40、60 Gy 60Co γ射線輻射處理的Parfait組培苗及秋水仙素誘導的四倍體Parfait組培苗共5個樣品，每個樣品組培苗繼代次數均在10次以上，隨機選取10株，每株分別取樣，然后混合，用于提取DNA。

1.2 試驗方法

1.2.1 模板DNA的制備與檢測

采用北京百泰克生物技術有限公司出品的新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取彩色馬蹄蓮葉片DNA；采用貝克曼庫爾特公司生產的DU800紫外/可見光分光光度計測定DNA純度和含量，并對濃度較高的樣品進行稀釋，-20 ℃儲存，備用。

1.2.2 RAPD-PCR 體系及引物篩選

以提取的彩色馬蹄蓮Parfait DNA為模板，參照陸波等的方法[3]，對北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成的40條引物進行多態性篩選，選擇條帶多態性強、擴增位點多的引物對供試的彩色馬蹄蓮品種及Parfait輻射誘變處理和多倍體進行RAPD擴增。

1.3 數據分析

每個樣品的擴增條帶按有（記為1）、無（記為0）進行記錄，在Excel表格上生成數據矩陣。計算擴增條帶的多態率，用POPGen32軟件[4]進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 彩色馬蹄蓮樣品RAPD分子標記結果

利用篩選出來的引物，對彩色馬蹄蓮 Parfait、Parfait四倍體和輻射誘變后代進行RAPD-PCR，最終篩選出具有特異性條帶的引物14個，共獲得90個位點，平均每個引物擴增出6.43個位點；其中，多態性位點39個，多態性位點比例為4333%。引物RAPD-47和RAPD-66擴增出的位點最多，均為9個；RAPD-73擴增出的位點最少，僅4個。引物RAPD-66擴增出的多態位點比例最高，為88.89%；有半數引物擴增出的位點全部為共有位點，多態性位點比例為0（表1）。由引物66擴增的RAPD圖譜（圖1）可見，多倍體誘導和 60Co γ射線輻射使Parfait擴增片段減少，從而表現出多態性。

2.2 彩色馬蹄蓮Parfait 四倍體及其輻射誘變后代分子水平變異分析

5個陳彩色馬蹄蓮樣品觀察到的等位基因數（na）為1402 1個，有效等位基因數（ne）為1.296 5個，Neis基因多樣性（h）為0.1666，Shannons多樣性指數（I）為0.242 1。

2.3 彩色馬蹄蓮Parfait多倍體及其輻射誘變與其他品種的親緣關系的聚類分析

由表2可知，40 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（Pr-2）與四倍體Parfait（Pr-D）遺傳相似系數最大，為0.886 6；Parfait與其60 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（Pr-4）間遺傳相似系數最小，為0.701 0；所有樣品遺傳相似系數的平均值0.791 8。

由圖2可以看出，5個樣品可分為2類，Pr、Pr-2和 Pr-D 聚為一支；Pr-2和Pr-4聚為一支。

3 結論與討論

自20世紀80年代以來，我國共引入彩色馬蹄蓮品種40多個。此后，我國研究人員對彩色馬蹄蓮的快繁技術[5-6]、栽培措施[7-9]、花期調控[10-12]和抗病生理[13-14]等進行了廣泛的研究，但關于彩色馬蹄蓮的分子生物學方面的研究僅有零星的報道[15-17]。在彩色馬蹄蓮品種間的親緣關系和多樣性分析方面，迄今只有張永春等利用ISSR對10個彩色馬蹄蓮品種進行鑒定[17]。本試驗利用RAPD技術研究多倍體誘導和 60Co γ射線輻射對彩色馬蹄蓮品種Parfait分子水平遺傳變異的影響，結果表明，Parfait、Parfait四倍體及其 60Co γ射線輻射處理多態性條帶比率最高為88.89%，平均值為 43.33%，多態性主要表現為多倍體誘導和 60Co γ射線輻射使Parfait的擴增片段減少，但這種多態性遠遠低于彩色馬蹄蓮品種間多態性[17]；但與陳臻等基于ISSR標記 12C6+重離子輻射下的彩色馬蹄蓮多態性十分接近[18]。各樣品間的遺傳相似系數最大為0.886 6，低于彩色馬蹄蓮品種間的遺傳相似系數[17]，說明多倍體誘導和 60Co γ射線輻射處理致使Parfait分子水平的變異已經達到了品種水平。在對其變異性狀及其穩定性進行觀測的基礎上，培育出彩色馬蹄蓮新品種是完全可能的。同時，各樣品多態性條帶比率最高達88.89%，表明通過建立彩色馬蹄蓮品種分子指紋圖譜鑒別彩色馬蹄蓮品種以解決市場上彩色馬蹄蓮品種混亂的問題是可行的。

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