酵母培養物對牦牛瘤胃發酵及甲烷產量的影響

孫紅梅　曹連賓　郝力壯等

摘要：為研究酵母培養物（YC）對牦牛瘤胃體外培養青藏高原高寒草甸4期牧草發酵產物及甲烷產量的影響，選取3頭健康的4歲瘺管牦牛為瘤胃液供體，采用體外產氣法，全年4期牧草作為發酵底物，每期牧草中分別添加0、1%、2%、3%、4% YC，篩選YC在每期牧草中的最佳添加量。結果顯示，YC可使枯草期產氣量下降（P<0.05），對返青期和枯黃期產氣量影響不顯著（P>0.05），添加2%YC組青草期產氣量顯著下降（P<0.05）；YC對發酵液的pH值和銨態氮濃度影響不顯著；在體外培養條件下，在維持牦牛瘤胃正常發酵環境且有改善牧草發酵后能量轉化率的情況下，分別在枯草期、返青期、青草期和枯黃期添加3%、2%、1%、2%YC可使其甲烷生成量比對照組顯著降低（P<005）。綜合考慮各試驗組，4期中枯黃期甲烷生成量最少，其中添加3%YC組最低。

關鍵詞：酵母培養物；牦牛；青藏高原；瘤胃；體外產氣；牧草；發酵參數；甲烷

中圖分類號： S858.236.9 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0177-06

酵母培養物（yeast culture，YC）是一種將酵母菌經特定厭氧發酵培養后形成的微生態制品，主要活性成分是酵母菌的各類代謝產物、發酵變異的培養基及少量酵母細胞，包括肽、有機酸、寡糖、氨基酸和一些芳香烴類物質[1]。YC作為反芻動物日糧添加劑的趨勢已越來越明顯，它有改善動物對飼料的消化率、增加瘤胃微生物蛋白（MCP）[2]、增加泌乳生產性能、提高動物免疫力的優勢[3]，是繼抗生素類添加劑之后作為綠色健康標簽而倍受矚目的新型飼料添加物。基于這些優勢，目前很多研究集中在YC對于動物瘤胃發酵、生產性能和飼料消化率的影響方面，而涉及對動物甲烷生成量影響的報道較少，在牦牛研究領域上也是一個空缺。因此，本試驗旨在探討YC對牦牛甲烷生成量的影響和對瘤胃發酵的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

青海省高原放牧家畜營養與生態國家重點實驗室培育基地、青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室和青海省高原牦牛研究中心進行牧草營養成分測定和體外產氣培養及相關指標評定。

1.2 試驗材料

根據青藏高原高寒草地實際情況采集4期牧草樣品，在三江源區核心區設置采樣樣地，采用1.0 m×1.0 m樣方，齊地面刈割，挑出不可食部分，稱質量并記錄，風干稱質量帶回實驗室，粉碎，過40目篩備用[4]。YC為市售商品。

1.3 試驗動物管理及日糧

選擇3頭健康、體質量接近、裝有永久性瘤胃瘺管的4歲牦牛作為瘤胃液供體，單獨飼喂。試驗日糧為燕麥青干草和小麥秸稈組成，全天自由采食，自由飲水，預飼15 d后開始正試期，晨飼前采集瘤胃液，采集至保溫瓶中迅速帶到實驗室。

1.4 牧草常規養分分析法

牧草的干物質（DM）、有機物質（OM）、粗蛋白質（CP）、粗脂肪（EE）、酸性洗滌纖維（ADF）、中性洗滌纖維（NDF）、非結構性碳水化合物（NFC）、灰分（Ash）、鈣（Ca）、磷（P）含量的測定均參照文獻[5]中的推薦方法。

1.5 體外產氣法

分別以全年4期天然混合牧草作為發酵底物，4期牧草培養為4個單因素獨立試驗，底物為220 mg，另外設置空白組（僅瘤胃液和培養液），作為產氣量校正。YC添加水平為0、1%、2%、3%、4%，每個水平設3個重復。通過瘤胃瘺管在晨飼前抽取牦牛瘤胃液混合后立即放入保溫瓶中備用，防止微生物區系發生變化。采用Menke 等的方法[6]準備緩沖液，并將緩沖液與瘤胃液以2 ∶1的比例混合，將混合好的培養液在發酵前通入CO2保證厭氧環境后，分液至對應編號的培養管內（30 mL），放入水浴（39±0.5） ℃的搖床上開始培養。

1.6 產氣量的記錄

從培養管放入培養箱中開始計時，在0、2、4、6、8、12、14、16、24、36、48 h快速讀數記錄。當讀數超過80 mL時，為了防止氣體超過刻度而無法讀數，需要排氣，收集氣體到對應編號集氣袋中，記錄排氣后的刻度值。

1.7 發酵參數測定

體外培養48 h后，將培養管取出放入冰水混合物中停止發酵。將發酵液排到50 mL玻璃管內，測定pH值；取部分發酵液經離心（4 000 r/30 min），取上清液進行氨態氮（NH3-N）濃度測定，測定方法參照改進的比色法[7]進行。

產氣量（mL）=該時間段內培養管產氣量（mL）-對應時間段內空白管平均產氣量（mL）；短鏈脂肪酸含量SCFA（mmol/L）=0.022 2×GP-0.004 25（r2=0.94）[8]；有機物質消化率OMD（%）=0.904 2×GP+0.049 2×CP+0038 7×CA+16.49（n=85，r2=0.93）；代謝能ME（MJ/kg，干物質）=0136×GP+0.005 7×CP+0.000 286×CP2+220（n=200，r2=0.94）；泌乳凈能NEL（MJ/kg，干物質）=0.096×GP+0003 8×CP+0.000 173×CP2+0.54（n=200，r2=0.93）[6]。其中：GP為24 h凈產氣量，mL；CP為粗蛋白含量，%；CA為灰分含量，%。

發酵氣體甲烷含量的測定委托蘭州中科安泰分析科技有限公司進行，分析條件[9]為儀器GC 3420 （北分瑞利氣相色譜儀）；檢測器FID（氫火焰檢測器）；柱長30 m，內徑 0.53 mm，膜厚20 μm；柱溫80 ℃；汽化溫度120 ℃；檢測溫度130 ℃；進樣量10 μL。

1.8 產氣動力學參數

1.9 數據統計分析

采用Excel 2003進行數據整理，SAS 9.1統計軟件中單因素試驗統計分析采用Duncans新復極差法進行多重比較，在0.05水平進行差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 4期牧草常規營養成分

全年4期高寒草地牧草常規營養含量（干物質基礎）見表1。

2.2 添加不同水平YC時4期牧草的累積產氣量

體外產氣試驗結果（表2）顯示，以枯草期牧草為發酵底物，添加YC降低了48 h累積產氣量，添加1%YC組與對照組差異不顯著（P>0.05），當添加量加大時，48 h累計產氣量顯著下降（P<0.05），但在發酵前12 h，枯草期添加3%、4%YC組，返青期添加1%、2%YC組，枯黃期添加4%YC組的產氣量均較其對照多（P<0.05）。在返青期，添加YC可以提高牧草的48 h累積產氣量，1%、2%YC組較對照組顯著提高（P<005），前12 h，YC對產氣量影響較小，之后出現顯著變化趨勢。在青草期，2%YC添加組各時間點的產氣記錄顯著低于對照（P<0.05）。枯黃期試驗未發現YC對累積產氣量影響顯著。

由表3可知，當在枯草期添加≥2%YC時，快速降解部分的產氣量A顯著增大（P<0.05），而慢速降解部分的產氣量B減小，其中添加4%YC組顯著減小（P<0.05），A+B下降，與48 h累積產氣量的下降吻合。YC對返青期A影響較小，因此在發酵前12 h各組間累積產氣量差異不顯著（P>005），B增加導致各組48 h累積產氣量升高；青草期A除添加2%YC組外均顯著升高（P<0.05），而B在添加1%、2%YC時顯著下降（P<0.05），添加2%YC組的A+B顯著下降（P<0.05），相應48 h累積產氣量也顯著減少（P<0.05）；YC對枯黃期各部分發酵影響不顯著（P>0.05）。各期YC不同添加水平對產氣速率常數c影響不顯著（P>0.05）。

2.3 添加不同量YC時4期牧草的發酵參數與甲烷產量

由表4可知，在4期牧草體外培養試驗中添加YC對pH值和NH3-N濃度影響在各期內均不顯著（P>0.05）；SCFA、OMD、ME、NEL的值在各期試驗統一添加水平時的變化趨勢一致，枯草期除添加2%YC組較對照組顯著下降（P<0.05）外，其余添加量組變化較小（P>0.05），隨添加水平的增加呈先減小后增大的趨勢；返青期這4個值受YC添加量的影響，隨添加量加大呈先增大后減小趨勢，添加2%YC組的各值較對照顯著增大（P<0.05）；在青草期添加2%YC時，這4個值比對照顯著小（P<0.05），當YC的添加量>2%時回升，但與對照組差異不顯著（P>0.05）；在枯黃期添加YC后，這4個值均與對照差異不顯著（P>0.05）。YC的存在可減少各期牧草體外發酵的甲烷產量，其中在枯草期添加≥2%YC組的甲烷產氣量顯著減小（P<0.05）；返青期YC各添加水平均能顯著降低甲烷產量（P<0.05）；青草期添加1%、2%、3%YC組的甲烷產量顯著減小（P<0.05），添加4%YC組的甲烷產量也低于對照，但差異不顯著（P>0.05）；枯黃期添加>1% YC能使甲烷產量顯著減小（P<0.05）。

經雙因素方差分析考察甲烷生成量，得到青草期>返青期>枯草期>枯黃期，且兩兩之間差異顯著（P<0.05）。其中，對照組的甲烷產量顯著高于各YC添加組（P<0.05），添加1%、4%YC組僅次之，差異不顯著（P>0.05），與生成甲烷最少的添加2%、3%YC組也均差異顯著（P<0.05），不同期與不同YC添加水平間存在互作（P<0.05），即不同期要求不同的YC添加量達到最佳的減少甲烷產量效果。經考核發現，枯黃期添加3%YC時的甲烷生產量最少。

3 結論與討論

關于YC在反芻動物瘤胃內的作用機理存在控氧理論、小肽營養代謝扳機理論和營養理論等3種理論。控氧理論認為，培養物質仍存在一些酵母菌，它作為好氧菌將瘤胃中的氧氣消耗掉后有利于瘤胃保持厭氧環境，對瘤胃微生物厭氧菌群（如纖維菌）生長發酵形成有利條件；小肽營養代謝扳機理論認為，培養物中所含的活性類似于小肽結構物質會促進瘤胃微生物活性而改變瘤胃發酵；營養理論認為，培養物中代謝產物包括有機酸、維生素、礦物質等，有利于微生物繁殖代謝而增強其發酵活性[12]。

3.1 YC對4期牧草體外發酵產氣量的影響

瘤胃發酵產氣主要來自飼料中OM的降解[6]，這些氣體包括一些揮發性酸類、CO2、H2及甲烷等[13]，產氣量反映飼料的可發酵程度，可用以衡量飼料營養價值[14]。枯草期前8 h產氣量升高，促進牧草OM中易降解部分發酵，A增大。有研究證實，YC能增加纖維菌的數量和活性[3，15]，酵母菌是好氧菌，其代謝過程會減少瘤胃內的氧氣，加強形成瘤胃厭氧環境，促進纖維分解菌等厭氧菌的代謝。飼料碳水化合物被纖維分解菌快速降解產生大量氣體，而隨微生物迅速增殖加大了對瘤胃內揮發性營養物質的消耗，因此累積產氣逐漸減少，同時A的增大彌補了B減少的量，因此僅添加4%YC組的產氣量顯著下降；在返青期，低濃度YC對牦牛瘤胃微生物的刺激作用較強，與OMD的增大一致，累積產氣量增多；在青草期期添加2%YC時，底物發酵被抑制，因為OMD顯著下降（P<0.05），發酵自始至終產氣顯著低于對照（P<0.05），說明添加2%YC對以青草期為底物的瘤胃微生物有抑制作用，其原因可能是青草期牧草營養相對均衡，P含量和Ca含量比例合理，而YC中也含礦物質和一些酶類，添加2%YC破壞了這種平衡，對微生物活性和對飼料降解不利；而添加YC對枯黃期牦牛瘤胃體外發酵產氣和OMD無影響，各添加水平下的變化與對照組差異均不顯著（P>0.05），A+B的變化趨勢與 48 h 累積產氣量趨勢一致。4期試驗添加YC對累積產氣量的影響變化不一致，主要受各期牧草營養成分影響，主要受飼料中ADF和NDF含量差異影響[16]。

3.2 YC對4期牧草體外培養48 h后各發酵參數的影響

通常情況下，反芻動物采食后瘤胃正常的pH值在5.5～7.5之間變動[17]，瘤胃酸堿環境與動物消化機能密切聯系，大至瘤胃原蟲，小至諸多作用酶等都對瘤胃內pH值很敏感，維持瘤胃正常的酸堿環境對機體正常代謝尤為重要[18]。氨態氮是飼料中蛋白氮和非蛋白氮等含氮物質被微生物分解代謝形成的終產物，大部分會被瘤胃微生物利用合成MCP[19]，成為反芻動物的蛋白質來源[20]，其濃度是飼料被分解程度和瘤胃微生物合成利用情況的平衡動態值，最適為0.065 8～0367 0 mg/mL[21]，即0.06～0.30 mg/mL[22]。分別進行的4期試驗結果顯示，與對照組相比，YC不同添加水平對pH值和NH3-N濃度影響均不顯著（P>0.05），與姜艷美等的結論[23]一致，說明YC不會改變動物瘤胃的正常運作機能，可使牦牛瘤胃內適宜酸堿環境和氮的循環保持良好平衡。雖然按照理論推測，因YC可促進纖維的快速降解，會加速有機酸累積，而使瘤胃pH值下降，但諸多試驗并未發現pH值下降，而是維持在恒定范圍內，這是因為YC中含有的二羧酸可通過促進瘤胃內乳酸利用菌的活性增強對乳酸的循環利用[24-25]，不致瘤胃形成過酸環境，可達到穩定pH值的效果，調節瘤胃內對酸環境敏感的菌群，增加瘤胃微生物菌群多樣性[26]，因此可添加YC防止動物因日糧中添加精料而導致酸中毒的現象。據報道[27]，YC能使飼料中的CP降解率提高，同時促進MCP合成，瘤胃細菌數增加是添加YC最顯著的變化，這是YC可提高動物生產力的源動力[28]。瘤胃微生物加快增殖，生成更豐富的MCP為機體提供蛋白質，因此YC可改善瘤胃內氮循環。本試驗中的NH3-N濃度均未受影響，但蔣小軍等的試驗結果顯示，YC添加后NH3-N濃度降低，因MCP合成迅速增加[29]，與微生物數量增加的報道一致，同樣是YC的積極效應；而Yoon等發現，YC能刺激蛋白分解菌增長[30]，一方面導致NH3-N生成增多，另一方面MCP合成加快，因此本試驗NH3-N濃度無變化。

SCFA也被認為是揮發性脂肪酸（VFA），可被瘤胃上皮細胞和瘤胃微生物直接吸收，是主要來自飼料中碳水化合物的降解產物。試驗證明，YC能促進纖維素及木質素的降解，改善瘤胃發酵，在總VFA中乙酸和丙酸占絕大多數，YC活性因子對瘤胃微生物群系有選擇性刺激作用，據報道，YC能提高產乙酸菌活性，增強產乙酸菌利用氫，可使乙酸產量增加5倍[31]，因為氫更多被用于合成乙酸，可被產甲烷菌利用的氫減少，這是本試驗得到添加YC后甲烷生成量減少的原因之一。在枯草期和青草期，隨YC添加量加大，SCFA含量先下降后上升，添加2%YC時顯著下降（P<0.05），而返青期的變化為先上升后下降，添加2%YC時顯著上升（P<0.05），這些變化與產氣量和OMD變化緊密相關，都源自YC對瘤胃微生物的刺激作用，進而造成飼料被分解程度的差異。在枯黃期添加YC后，SCFA與對照差異不顯著。這與Williams等的結論[32]一致。不同水平YC對4期牧草產生的SCFA量影響變化不一致，主要受牧草營養類型差異的影響，有研究指出，VFA量會隨YC添加時間及日糧類型變化而變化[33]。有研究顯示，活性釀酒酵母能提高真菌對纖維的分解能力，顯著提高甲酸、乳酸、乙酸等的濃度[34]，因此SCFA濃度增大；但有報道，酵母培養物對總VFA無影響[32]。

3.3 YC對4期牧草體外培養生成甲烷量的影響

聯合國專委會表示，每年僅反芻動物向大氣中排放的甲烷量達85 Tg，占全球溫室效應危害的2%左右[35]，與此同時，反芻動物瘤胃甲烷的產生也浪費掉2%～12% 的飼料總能[36]，面臨高寒牧區天然草場日漸退化的壓力，在可持續發展和減排溫室氣體的脅迫下，有效抑制甲烷的研究就變得尤為重要。據報道，產乙酸菌生成乙酸的過程需要H2的參與，YC能刺激瘤胃中產乙酸菌利用H2，甚至添加活酵母菌能使乙酸產量及產乙酸菌利用H2效率提高5倍，這樣增強與產甲烷菌競爭氫的作用，會有效減少甲烷的生成。改變瘤胃發酵方式，乙酸含量/丙酸含量的值減小[25]，丙酸大量形成消耗氫，可減弱甲烷的生成。但這種效果與日糧類型關聯，因此出現不一致的結論[37]。甲烷的減少還與原蟲數量減少相關，YC可減少瘤胃中45%的原蟲[38]。枯草期添加≥2% YC可顯著降低甲烷生成量，但添加2%YC組的SCFA、OMD、ME、NEL顯著減小（P<0.05）；返青期添加YC各組的甲烷生成量均下降（P<005），其中添加2%YC組對底物發酵程度的促進作用更大，能量轉化率顯著增大（P<0.05）；青草期添加4%以下YC組的甲烷生成量顯著下降（P<0.05），對添加1%YC組的飼料能量轉換無影響，而添加2%YC組的能量轉化效率下降，雖然4%YC使SCFA含量升高，OMD、ME、NEL均提高（P<005），但甲烷未見減少；在不影響能量轉化時，添加2%YC可顯著減少枯黃期的甲烷生成量（P<0.05）。

枯草期產氣量因YC的添加而下降（P<0.05），對返青期和枯黃期產氣量影響不顯著（P>0.05），添加2%YC組的產氣量在青草期顯著下降（P<0.05）。在維持牦牛瘤胃正常發酵環境和有效改善飼料能量轉化率的情況下，分別在枯草期、返青期、青草期、枯黃期添加3%、2%、1%、2%YC可使甲烷生成量顯著降低（P<0.05）。其中，枯黃期的甲烷生成量最少，且該生育期添加3%YC組為各試驗組的最低值。

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