利用湖羊生產人ApoB多抗血清免疫新方法

徐志偉　劉泉　時小艷等

摘要：利用湖羊生產羊抗人ApoB，將人ApoB免疫原經湖羊皮下與皮內及淋巴結多點接種并進行多次加強免疫，建立利用湖羊生產人ApoB多抗血清免疫的新方法，獲得高效價抗人ApoB抗體，并且采用瓊脂擴散方法檢測抗體效價。結果顯示，5次免疫后的羊抗人ApoB多抗血清效價達210以上，試驗結果達到預期，湖羊采用合適的免疫程序完全可以生產抗血清，經濟效益可觀。

關鍵詞：湖羊；人ApoB；抗血清；瓊脂擴散法

中圖分類號： S852.5 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0186-02

傳統的畜禽養殖業利潤較少，且受市場行情及疾病影響較大，抵御市場風險能力差，亟需轉變傳統養殖觀念，提高養殖經濟效益。把生物技術引入畜禽養殖業，以畜禽為載體，為人類生產各類生物制品（特定蛋白、特異性抗體、特殊材料等），既可以解決傳統養殖利潤低的問題，又可以為人類提供高品質蛋白，降低醫療成本。以羊生產羊抗人的抗體計算，1只羊利潤約1萬元，大大高于傳統養羊的利潤。載脂蛋白B（ApoB）被認為是包含載脂蛋白的脂蛋白的顯著標記，ApoB是脂蛋白結構的限制因素[1]。研究表明，人ApoB對于糖尿病、急性冠狀動脈綜合征等心血管疾病的診斷及后期臨床治療具有重要意義[2]。目前通過免疫羊獲得羊抗人抗體的效價不高，如何提高抗體效價是利用羊生產人抗體的主要限制因素之一。本研究利用湖羊制備人ApoB多抗血清，對原有的常規免疫程序加以改進，建立一套從湖羊免疫、血清采集到抗體效價檢測的生產方法，旨在為增加養殖業附加值、提高養殖戶收入提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用體質量約35 kg的健康青年湖羊25只，免疫前全部打上耳標，采用群養放牧飼養方式，白天放牧4 h，上午、下午各 2 h，晚上添加少量精料，有利于羊身體健壯，避免過肥，自動飲水，每天早晚各觀察1次羊的健康狀況。

1.2 抗原

人ApoB抗原自行制備，純度高于98.5%，接種前0.1 mL抗原（含1 mg抗原）+1.9 mL無菌PBS+2 mL弗氏完全（或不完全）佐劑充分混合，制成4 mL免疫原乳劑備用。

1.3 湖羊免疫方法程序

首免：每只羊接種4 mL免疫原乳劑，注射方式為皮下與皮內注射，共計16個注射點。分別為頜下、背部皮下各2個點；后足窩皮下共2個點；前腹股溝皮內各2個點；后腹股溝皮內各3個點注射。二免：首次后第15天進行二免，皮下與淋巴結注射，共計18個注射點。分別為頜下、背部皮下各2個點；前腹股溝皮下各2個點；后腹股溝皮下各3個點；前后腹股溝淋巴結共計4個點。三免：二免后第10天進行三免，皮下注射，共計14個注射點。分別為頜下、背部皮下各2個點；前腹股溝皮下各2個點；后腹股溝皮下各3個點。四免：三免后第10天進行四免，免疫方式同三免。五免：四免后第10天進行五免，免疫方式同三免。

1.4 血清制備與血清效價測定

分別于三免、四免后7～8 d采靜脈血5～10 mL進行血清分離，采用瓊脂擴散法檢測血清抗體效價，剩余血清 置于-20 ℃ 冰箱凍存，標注抗體效價。第5次免疫注射后第 7～10 天經抗體效價檢測，若供血羊準備重復利用，則每只羊根據體質量采血280～320 mL；若供血羊不準備重復利用，則將所有血采完，根據羊的體質量一般可采血900～1 200 mL。將采得的全血放入容器內，38 ℃水浴中靜置 1.5～2.0 h，使血清充分析出，取出置于4～5 ℃冰箱中保存過夜。

1.5 瓊脂板配制

配制0.01 mol/L PBS液，配方為NaCl 4.25 g、磷酸氫二鈉1.35 g、磷酸二氫鈉0.195 g、蒸餾水500 mL混勻，pH 值74。取100 mL PBS液置于燒杯中，加入優質瓊脂1 g，2%疊氮鈉或1%硫柳汞1.0 mL，沸水中融化均勻，將已融化的瓊脂趁熱倒入平皿中，制成3 mm 厚的瓊脂板，冷卻后備用。

1.6 結果判定

分別設置標準陰性對照孔、標準陽性對照孔，在標準陽性對照孔與抗原孔之間出現明顯的致密白色沉淀線，標準陰性孔不出現沉淀線的前提下，將被測孔與對照孔進行比對，以判定陰陽性。利用Excel軟件記錄數據，并進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 血清的產出

從接種人ApoB抗原的羊體中，通過頸靜脈采血10～20 mL，裝于離心管中傾斜放置，放于38 ℃水浴箱中孵育 1.5～2.0 h，再放入4 ℃ 冰箱過夜。第2天在無菌操作臺上操作，移液器吸取血清上清液，放于指形管中，在指形管標記人ApoB及日期成功獲得人ApoB血清上清液。經離心沉淀分出血清，根據每批血清的抗體效價進行抗體標準濃度調整與稀釋，分裝后置于-20 ℃冰箱冷凍保存。

2.2 血清效價及檢測效果

通過瓊脂擴散法檢測血清效價，結果表明，三免后，血清抗體效價為1 ∶26，四免時增長到1 ∶28，五免抗體效價為 1 ∶210，達到后續用于制備檢測試劑盒或者其他醫學用途的抗體水平（表1）。

2.3 抗體生成規律

如圖1所示，以效價對log2作圖，結果顯示：四免后所采集抗人ApoB血清效價比三免提高2 個數量級（或更高），五免比四免提高2個數量級（或更高）。筆者認為，五免后7 d內抗體效價可能升幅不高，10～20 d左右抗體效價處于高平臺期。

3 結論與討論

聯合檢測載脂蛋白A 與載脂蛋白B（ApoB）對血脂的判斷具有重要的臨床價值[3-4]。由于ApoB在脂質組裝、轉運過程中起核心作用，ApoB基因的遺傳變異可能幫助解釋脂質水平與嚴重動脈粥樣硬化、冠心病之間的關系。測定載脂蛋白及脂蛋白HDL、LDL對分析病理發生狀態很有幫助。由此可見ApoB對于醫學診斷及疾病治療的重要性。目前生產大量抗血清，主要采用大型家畜，包括馬、綿羊、山羊等，這類家畜壽命較長，容易管理，不必施行麻醉即可從頸靜脈采集大量血液，故主要用于抗血清的商品化生產[6]。本試驗的主要創新點在于免疫程序方面，常規的免疫程序中注射方式一般都為皮下注射，本試驗中首免時將腹股溝的皮下調整為皮內注射，這樣注射的好處是二免時淋巴結會腫大，方便進行淋巴結注射，淋巴結注射亦是本試驗的創新點，淋巴結是重要的免疫器官，理論上抗體生成效率更高，本試驗五免之后的抗體效價能達到210，達到預期水平，可用于后期的商業化生產，具有較高的經濟收益。本試驗需要免疫5次，抗體效價才能符合生產要求，一方面2種抗體效價檢測方法不同，不具備可比性；另一方面推測免疫原本身在羊上不易產生高的效價，尚需進一步研究。

參考文獻：

[1]Uchide T，Tohya Y，Onda K，et a1.Apolipoprotein B （apoB） concentrations in lipopmteins in cows [J]. Vet Med Sci，1997，59（8）：711-714.

[2]姜偉超，張德太，張 科，等. 糖尿病及急性冠狀動脈綜合征患者ApoB與ApoA1比值測定的臨床意義[J]. 臨床血液學雜志：輸血與檢驗版，2013，26（6）：837-840.

[3]Hirata T，Fujioka M，Takahashi Ka，et al. ApoB C7623T polymorphism predicts risk for steroid-induced osteonecrosis of the femoral head after renal transplantation[J]. Journal of Orthopaedic Science，2007，12（3）：199-206.

[4]陳保生. 載脂蛋白的結構和功能與病毒病的預防和治療[J]. 中國醫學科學院學報，2007，29（3）：448-451.