細顆粒物PM2.5暴露加重博來霉素致大鼠肺纖維化

段 爭，吳翠紅

(1.河北醫科大學第二醫院 呼吸二科， 河北 石家莊 050000； 2.故城縣醫院 內一科， 河北 衡水 253800)

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研究論文

細顆粒物PM2.5暴露加重博來霉素致大鼠肺纖維化

段 爭1*，吳翠紅2

(1.河北醫科大學第二醫院 呼吸二科， 河北 石家莊 050000； 2.故城縣醫院 內一科， 河北 衡水 253800)

目的探討細顆粒物(PM2.5)暴露對博來霉素致大鼠肺纖維化的影響。方法將大鼠分為4組：1)對照組 (N組)；2)PM2.5組(PM組)；3)博來霉素組(BLM) (B組)；4)PM2.5+博來霉素組(PM+B組)；每組再分為4個亞組，均為6只。分別予以氣管內滴注0.9%氯化鈉注射液(1.5 mL/kg)，PM2.5懸液(3.75 mg/kg)，BLM懸液(3.5 mg/kg), BLM和PM2.5混懸液，于 3、7、14和21 d處死大鼠，行肺組織HE染色和Masson染色，進行肺泡炎及肺纖維化評分，計數肺泡灌洗液(BALF)中白細胞及分類，ELISA法測BALF中IL- 6、TNF-α和TGF-β1含量；Western blot測定Toll 樣受體(TLR)2和TLR4蛋白表達；測定肺組織勻漿中羥脯氨酸含量。結果B組和PM+B組體質量較N組明顯下降，PM+B組較B組體質量明顯下降(P<0.05)。B組和PM+B組肺泡炎及肺纖維化評分顯著高于N組和PM組。B組和PM+B組白細胞總數及中性粒細胞比例、BALF中IL- 6、TNF-α和TGF-β1含量及肺組織羥脯氨酸含量均顯著高于N組和PM組(P<0.05)，且PM+B組高于B組。PM組、B組、PM+B組肺組織TLR2、TLR4蛋白表達顯著高于N組(P<0.05)，PM+B組顯著高于B組和PM組。結論PM2.5暴露加重博來霉素致大鼠肺纖維化，其機制可能通過上調肺組織TLR2及TLR4表達和增加IL- 6、TNF-α及TGF-β1分泌。

細顆粒物；博來霉素；肺纖維化；Toll 樣受體(TLR)

肺纖維化病因不明,肺泡炎性反應是其特征之一，氧化-抗氧化失衡在其發展中發揮關鍵作用，環境中粉塵參與了肺纖維化的發生發展。細顆粒物(PM2.5)可沉積于支氣管及肺泡，并可吸附病原微生物、芳香烴等物質。研究證實PM2.5暴露可通過誘發肺臟炎性反應和誘導氧化應激等途徑參與肺炎、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)等呼吸系統疾病的發病[1- 3]。PM2.5暴露是否參與肺纖維化的發生發展尚不清楚。本研究氣管內滴入博萊霉素建立大鼠肺纖維化模型，氣管內滴入PM2.5進行干預，探討PM2.5暴露對大鼠肺纖維化的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級6～8周齡雌性SD大鼠96只，體質量200～220 g，(河北醫科大學實驗動物中心，合格證號：1302094)。PM2.5(石家莊市環境監測中心)，以蒸餾水配制成7.5 mg/mL懸液備用。博來霉素(BLM)A(天津太河制藥有限公司)；白細胞介素(IL)- 6試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒和轉化生長因子(TGF)-β1試劑盒(均河北博海生物工程開發有限公司)；羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗大鼠Toll樣受體(TLR)2一抗、TLR4一抗(Santa Cruz公司)；山羊抗兔TLR2二抗、TLR4二抗(北京中山金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備：96只大鼠分為對照組(N組)；PM2.5組(PM組)：氣管內滴入PM2.5懸液(3.75 mg/kg)；博來霉素組(B組)：博來霉素A5以3.5 mg/kg氣管內滴入；PM2.5與博來霉素聯合組(PM+B組)：博來霉素A5與PM2.5配成混懸液氣管內滴入。各組按照不同時間點(3、7、14和21 d)分為4個亞組，每個亞組6只，于各時間點處死大鼠，取材測定相應指標。

1.2.2 體質量測量：記錄大鼠體質量，計算體質量變化值=各時間點體質量值-初始體質量值。

1.2.3 肺病理組織學染色及分級：取右肺下葉，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，行HE染色和Masson染色。參照文獻進行肺泡炎和肺纖維化程度分級評分，各分為4級。

1.2.4 肺泡灌洗液(BALF)細胞計數及分類：3 mL 4 ℃ 0.9%氯化鈉注射液行左肺灌洗，反復抽吸3次，回收全部BALF，4 ℃1 200 r/min離心10 min，離心半徑10 cm。用計數板在光鏡下細胞計數，瑞氏染色，油鏡下行細胞分類計數，共計數200個細胞。

1.2.5 BALF中IL- 6、TNF-α和TGF-β1的測定：BALF離心后取上清液，-80 ℃保存備用。用酶聯免疫吸附試驗方法測定，具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.6 肺組織羥脯氨酸(HYP)含量測定：取21 d大鼠右肺上葉-70 ℃保存備用。用堿水解法測定，具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 體質量改變

B組與PM+B組體質量在7 d時降至最低，B組和PM+B組體質量較N組明顯減低(P<0.05)；PM+B組較B組體質量明顯減低(P<0.05)。

2.2 肺組織病理學改變

PM組早期呈肺泡炎改變，后期肺泡炎恢復。B組早期呈肺泡炎表現，后期肺泡炎減輕，以纖維化為主。PM+B組改變與B組大體相同，早期肺泡炎及后期纖維化程度明顯加重(圖1)。

2.3 肺組織病理分級評分

肺泡炎評分：PM組在3 d時高于N組(P<0.05)，PM+B組和B組在各時間點均顯著高于N組和PM組，PM+B組在3和7 d時顯著高于B組(P<0.05)。肺纖維化評分：B組和PM+B組在7、14和21 d時顯著高于N組和PM組(P<0.05)，PM+B組14 d時顯著高于B組(P<0.05)。

2.4 BALF中白細胞計數及分類比較

PM組3 d時BALF中白細胞總數及中性粒細胞比例顯著高于N組(P<0.05)，B組和PM+B組在各個時間點均顯著高于N組和PM組(P<0.05)，PM+B組高于B組(P<0.05)(表1)。

2.5 BALF中IL- 6、TNF-α、TGF-β1及肺組織中HYP含量比較

PM組3 d時BALF中IL- 6、TNF-α顯著高于N組(P<0.05)，B組和PM+B組BALF中IL- 6、TNF-α和TGF-β1含量及肺組織HYP含量在各檢測點均顯著高于N組和PM組(P<0.05)，PM+B組高于B組(表2)。

2.6 肺組織中TLR2、TLR4蛋白表達

N組、PM組、B組和PM+B組肺組織TLR2吸光度比值分別為0.442±0.002、0.491±0.002、0.546±0.002和0.731±0.003；TLR4吸光度比值分別為0.414±0.001、0.486±0.002、0.484±0.001和0.726±0.001。PM組、B組和PM+B組肺組織TLR2和TLR4表達顯著高于N組，PM+B組顯著高于B組和PM組(P<0.05)(圖2)。

A～D.HE； E～F.Masson; A.group N; B.group PM; C.group B; D.group PM+B; E.group N; F.group PM; G.group B; H.group PM+B (×100)

圖1 各組大鼠第21天肺臟病理改變

*P<0.05 compared with N group;△P<0.05 compared with PM group;▲P<0.05 compared with B group.

圖2 各組大鼠肺組織TLR2、TLR4蛋白表達

groupIL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)3days7days3days7daysN15.4±1.117.3±1.367.7±4.162.9±2.5PM33.8±1.4*19.5±1.1101.3±3.2*63.1±3.2B49.0±0.9*△101.5±2.0*△162.3±8.2*△258.8±6.9*△PM+B79.4±2.2*▲△125.6±3.6*▲△268.6±5.9*▲△410.8±7.8*▲△groupTGF-β1(ng/L)HYP(μg/g)3days7days14days21days21daysN50.8±1.839.8±2.641.3±0.832.3±1.1141.0±5.5PM52.9±2.140.0±2.340.7±1.534.0±1.5148.5±5.3B154.1±5.7*△169.5±7.1*△197.3±4.1*△184.6±4.5*△437.0±12.7*△PM+B176.5±7.6*▲△196.1±7.7*▲△223.1±4.5*▲△192.2±4.6*△523.1±10.9*▲△

*P<0.05 compared with N group;△P<0.05 compared with PM group;▲P<0.05 compared with B group.

3 討論

本研究證實PM2.5暴露可致大鼠肺臟炎性反應，無肺纖維化，BLM與PM2.5聯合組較BLM組肺纖維化加重，提示PM2.5暴露加重肺纖維化。有關PM2.5對肺纖維化影響的研究較少，且結果不一致。14納米碳黑顆粒可加重BLM誘導的大鼠肺臟炎性反應和纖維化[4]。大鼠氣管內滴入90納米碳黑顆粒不加重BLM誘導的肺纖維化，胸膜內聯合予以BLM及碳黑顆粒可加重BLM誘導的胸膜下纖維化[5]。這些研究結果的差異與實驗應用的顆粒物化學成分、大小及給藥方式等不同相關。

本研究表明聯合組BALF細胞數、IL- 6、TNF-α及TGF-β1均較BLM組增高，提示PM2.5暴露加重BLM誘導的肺臟炎性反應。TNF-α可促進細胞間黏附，放大炎性反應級聯反應，IL- 6可促進纖維化相關介質TGF-β1、CCL- 3上調，TGF-β1是成纖維細胞招募、激活和分化的中心調節者。因而PM2.5誘導的炎性反應介質升高不僅引起炎癥性肺損傷, 還可誘導炎性反應級聯反應，加重肺纖維化。

Toll 樣受體(Toll-like receptor, TLR) 是一類天然免疫模式識別受體，TLR4和TLR2是應答顆粒物的主要受體。關于PM2.5暴露對于TLRs影響的研究結果并不一致，PM2.5暴露引起大鼠BALF和血中TLR2和TLR4陽性細胞下降[6]；亞洲沙塵暴顆粒聯合肺炎克雷伯桿菌可增加TLR2表達，抑制TLR4表達[7]；香煙煙霧使人巨噬細胞TLR4mRNA上調[8]。本研究證實PM2.5暴露使肺組織TRL2、TRL4表達上調。TLRs參與了肺纖維化的進程。肺纖維化患者BALF淋巴細胞TLR2表達升高[9]。BLM上調大鼠肺組織TLR2表達[10]，TLR2受體阻斷劑可減弱BLM的炎性反應效應和纖維化效應[11]。TLR活化后啟動細胞內信號，激活MAPK家族，啟動下游炎性反應介質，加重肺纖維化。

本研究證實PM2.5暴露通過上調肺組織TLR2、TLR4表達，使IL- 6、TNF-α、TGF-β1分泌增加，加重肺臟炎性反應及纖維化。

[1] 段爭, 杜飛燕, 袁雅冬，等. 細顆粒物暴露對大鼠肺臟清除克雷伯菌的影響[J].中華結核和呼吸雜志, 2013,36:836- 840.

[2] 段爭, 次如冰, 劉小強，等. 空氣PM2.5暴露對肺炎克雷伯菌致大鼠肺部炎性反應的影響[J]. 基礎醫學與臨床, 2014,34:1110- 1112.

[3] Kloog I, Nordio F, Zanobetti A,etal. Short Term Effects of Particles Exposure on Hospital Admissions in the Mid-Atlantic States:A Population Estimate[J]. PLoS One, 2014, 9:e88578. doi: 10.1371/journal.pone.0088578. eCollection 2014.

[4] Kamata H, Tasaka S, Inoue K,etal. Carbon black nanoparticles enhance bleomycin-induced lung inflammatory and fibrotic changes in mice[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2011, 236:315- 324.

[5] Decologne N, Wettstein G, Kolb M,etal. Bleomycin induces pleural and subpleural fibrosis in the presence of carbon particles[J]. Eur Respir J, 2010, 35:176- 185.

[6] Zhao C, Liao J, Chu W,etal. Involvement of TLR2 and TLR4 and Th1/Th2 shift in inflammatory responses induced by fine ambient particulate matter in mice[J]. Inhal Toxicol, 2012, 24:918- 927.

[7] He M, Ichinose T, Yoshida S,etal. Asian sand dust enhances murine lung infl ammation caused by Klebsiella pneumoniae[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 258:237- 247.

[8] Sarir H, Mortaz E, Karimi K,etal. Cigarette smoke regulates the expression of TLR4 and IL- 8 production by human macrophages[J]. J Inflamm (Lond), 2009, 6:12. doi: 10.1186/1476- 9255- 6- 12.

[9] Samara KD, Antoniou KM, Karagiannis K,etal. Expression profiles of Toll-like receptors in non-small cell lung cancer and idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Int J Onco, 2012, 40:1397- 1404.

[10] 劉含智，楊紅振，米粟，等. TOLL樣受體2介導博來霉素誘導的急性肺損傷、炎癥與纖維化[J]. 藥學學報，2010,45:976- 986.

[11] Yang HZ, Cui B, Liu HZ,etal. Targeting TLR2 Attenuates Pulmonary Inflammation and Fibrosis by Reversion of Suppressive Immune Microenvironment[J]. J Immunol, 2009, 182:692- 702.

Exposure to PM2.5 enhances Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats

DUAN Zheng1*, WU Cui-hong2

(1.the Second Dept. of Respiratory, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000;2.Dept. of Medicine, Gucheng County Hospital, Hengshui 253800, China)

Objective To investigate the effects of exposure to PM2.5 on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Methods Rats were divided into four groups：1) control group(group N); 2)PM2.5 group(group PM); 3)BLM group(group B); 4)PM2.5 plus BLM group (group PM+B)；Each group was divided into four groups. Rats were injected of normal saline (1.5 mL/kg), PM2.5 suspended in saline(3.75 mg/kg), bleomycin (3.5 mg/kg) and PM2.5 combined with BLM in saline into trachea respectively. The rats were sacrificed on day 3, 7, 14 and 21. The lung were stained with HE and Masson’s trichrome to estimate the degree of alveolitis and pulmonary fibrosis. Bronchoalveolar lavage fluid(BALF)was collected and cells in BALF were counted. The levels of IL- 6,TNF-α and TGF-β1 in BALF were detected by the method of enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). Western blot was performed to detect the protein level of TLR2 and TLR4 in lung. The lung was made into tissue homogenate which were used for measuring the contents of HYP in pulmonary tissue. Results The body weight of rats in group B and group PM+B significantly decreased as compared with that in the group N. The rats in group B and group PM+B exhibited significant alveolar inflammation and fibrosis as compared with that of group N and group PM. The numbers of WBC in BALF and the concentration of IL- 6, TNF-α, TGF-β1 and hydroxyproline were significantly elevated in Group B and group PM+B as compared with that in group N and group PM. The protein level of TLR2 and TLR4 in the lungs in group B, group PM and group PM+B was significantly higher than that in group N.Conclusions Exposure to PM2.5 may impact the concentration of IL- 6, TNF-α and TGF-β1 by increasing TLR2 and TLR4 expession, which exaggerate BLM-induced inflammation and fibrosis of the lung.

fine particulate matter; bleomycin; pulmonary fibrosis; Toll-like receptor (TLR)

2014- 12- 01

2015- 03- 25

河北省省級科技計劃(15277701D)

1001-6325(2015)06-0781-05

R563.9

A

*通信作者(corresponding author)：duanzheng1971@126.com