Cd2+對淡水底棲硅藻Nitzschiaamplectens生長的影響

李婭　支崇遠　孫翠翠等

摘要：對不同濃度Cd2+中淡水底棲硅藻Nitzschia amplectens的存活數、葉綠素a含量及運動速度進行測定，以探索硅藻對重金屬毒性的響應規律，為硅藻監測水體污染提供科學依據。純化培養Nitzschia amplectens，生長數量達到7萬個/mL時，加入不同濃度的Cd2+進行急性毒性和亞急性毒性脅迫培養。在急性毒性試驗中，Nitzschia amplectens的存活數在96 h的EC50值為4.989 mg/L。在亞急性毒性試驗中，培養15 d后Cd2+濃度為0.625、0 mg/L的Nitzschia amplectens運動平均速度為2.5、5.56 μm/s，其余試驗組無運動跡象；培養13 d后，Cd2+濃度與葉綠素a含量呈負相關（P<0.05）。Cd2+濃度對Nitzschia amplectens的生長、運動速度和葉綠素a含量有明顯影響，所以Nitzschia amplectens具監測水體重金屬Cd2+污染潛力。

關鍵詞：Nitzschia amplectens；重金屬Cd2+；培養；生長；運動；葉綠素a；水質監測；指示生物

中圖分類號： Q945.78；X832 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0305-03

鎘是一種生物毒性很強的重金屬，能在有機體內積蓄，通過食物鏈傳遞富集可引起生物體生長緩慢甚至死亡[1]。隨著工業的發展，大量的Cd2+向環境中排放，使得環境中的Cd2+污染加重。中國水體鎘污染時有發生，2012年1月15日廣西龍江河宜州拉浪段發現重金屬鎘超標，至1月21日18時污染事件已造成約28.1萬尾魚死亡。目前鎘已被美國毒理管理委員會（ATSDR）列為第6位危及人體健康的有毒物質，被聯合國組織確定為優先檢測的環境污染物[2]。

底棲硅藻是一種單細胞生物，分布很廣，是水體中的初級生產者，在光合作用下它們吸收水中的無機鹽和二氧化碳，制造有機物[3-4]，它們對凈化水質具有重要意義。2000年歐共體水框架指南（Water Framework Directive of the European Union）推薦硅藻為水體監測生物指標。底棲硅藻對許多環境變量（pH值、光、鹽度、溫度、無機營養濃度等）敏感[5-6]，它們與水體重金屬關系的研究已有一些報道。Nitzschia amplectens Hustedt是中國西南地區河流中常見淡水底棲硅藻，其與重金屬關系的系統研究報道甚少。探索Nitzschia amplectens與Cd2+的關系，可為生物監測水質增加新的內容。

1 材料與方法

1.1 藻種

藻種Nitzschia amplectens Hustedt采集于貴州省烏江上游畢節市七星關區層臺鎮玉龍鄉河流中段。

1.2 儀器設備

主要儀器有顯微鏡（NIKON EOLIPSE 50i）、生化培養箱（SPX-250）、水浴鍋、超凈工作臺、離心機和微量移液器等。

1.3 底棲硅藻自制培養基

1.3.1 培養基基礎液 培養基基礎液配制見表1。

1.3.2 土壤浸出液配制 稱取500 g土壤（土壤采集于貴州省貴陽市相寶山地區），去離子水1 L，混合后用塑料薄膜封口，沸水浴加熱1 h，冷卻，離心，過濾，取上清液，加蒸餾水至總體積1 000 mL，置于10.1 MPa高溫下滅菌30 min，保存于 4 ℃ 備用。

1.3.3 Nitzschia amplectens培養基 將配制好的培養基基礎液與土壤浸出液以一定的比例混合，用NaOH液將pH值調至7.5±0.5，經0.2 μm濾膜，滅菌，得到Nitzschia amplectens培養基。

1.4 純化培養和脅迫培養

1.4.1 Nitzschia amplectens的分離及純化培養 將野外采集的硅藻樣品帶回實驗室，用50目的篩絹過濾水樣，放于顯微鏡下觀察，采用微吸管分離法，通過多次抓取，將Nitzschia amplectens藻種分離出來，即可將此放入自制培養基中在培養箱中培養。

培養條件：溫度（24±1） ℃，光照周期12 h ∶12 h，光照度1 800 lx。每天12：00和19：00搖動藻液1 min，以防硅藻附在玻璃壁上。

1.4.2 Cd2+急性毒性脅迫培養 09：00—10：00在顯微鏡下用血球計數板統計藻密度，當藻種數量達到約7萬個/mL時，用 500 mL 的培養瓶分裝藻液，進行擴大培養，培養條件同“1.4.1”節。

取7個100 mL培養瓶（1個對照組+6個試驗組），加入藻液40 mL，藻液密度為7萬個/mL，再分別在各培養瓶中滴加 Cd2+液，7個瓶中Cd2+濃度最終調節依次為0、0.5、1、2、5、10、15 mg/mL，重復3次。按“1.4.1”節培養條件培養，在培養后0、24、48、72、96 h取樣，用血球計數板計數，所得數值通過計算得出96 h EC50值。先算出抑制率X：X=（I0-I）/I×100%（式中：I0為Cd2+濃度為0時的特定生長率；I為試驗組特征生長率），通過SPSS的Probit分析計算得出EC50。

1.4.3 Cd2+亞急性毒性脅迫培養 取5個500 mL培養瓶（1對照組+4試驗組），放入藻液200 mL，藻液密度7萬個/mL，試驗組Cd2+濃度梯度設置為96 h EC50、96 h EC50/2、96 h EC50/4、96 h EC50/8[7]，對照組為空白。進行亞急性毒性培養（培養條件同“1.4.1”節）。觀察期為15 d，前3 d每天09：00取樣1次，之后每隔2 d取樣1次，每次取樣為10 mL，共計9次，對所取藻液進行葉綠素a含量的測定及對硅藻運動情況觀測。endprint

隨著Cd2+脅迫培養時間的延長，Cd2+對Nitzschia amplectens生長的抑制作用增強。96 h的EC50值為4.989 mg/L，根據藻類生長抑制毒性分級標準[9]可知，Cd2+對Nitzschia amplectens屬于高毒，對其生長的抑制作用較大。

2.2.2 Cd2+濃度對Nitzschia amplectens運動狀態的影響 由于硅藻的生殖方式為二分裂生殖，藻的體積會減小，運動情況也會受到影響，所以總體運動趨勢處于緩慢下降。由圖2可知，經過15 d的Cd2+脅迫培養，Cd2+濃度對Nitzschia amplectens的運動的抑制作用十分明顯。1 d后，藻的運動速度與Cd2+濃度呈負相關關系，其一元回歸線性方程為y=-0.409x+3.584（P<0.05），在Cd2+濃度為2.495 mg/L的藻液中，所有藻就已停止運動（Cd2+濃度為4.989 mg/L的藻液中，所有藻停止運動，未在圖2中標出）；在Cd2+濃度為1247 mg/L的藻液中培養7 d后，藻也停止了運動。由此可見，Cd2+濃度對Nitzschia amplectens的運動速度有很大的影響。

2.2.3 Cd2+對Nitzschia amplectens葉綠素a含量的影響

藻類的光合作用與其體內葉綠素的含量密切相關，葉綠素的含量若受到影響，則會影響藻細胞的生長，因此有必要對在Cd2+脅迫培養下的菱形藻的葉綠素a含量進行測定。由圖3可知，在不同濃度Cd2+的條件下對藻培養15 d，前3 d 葉綠素a的總含量變化不是很大；培養后5 d，Cd2+濃度為4.989 mg/L的生長抑制率達到最大，葉綠素a總含量下降。5 d后，Cd2+濃度為4.989、2.495、1.247 mg/L藻液中的葉綠素a含量基本不再增加，對照組的葉綠素a含量則明顯增加，說明Cd2+對該種菱形藻的的葉綠素a含量有一定影響。計算13 d后葉綠素含量與Cd2+濃度相關系數r=-0.797，呈負相關關系，一元回歸線性方程為y=-0.251x+4.782（P<0.05），說明Cd2+濃度對藻光合作用能力有一定影響，且隨著培養時間和Cd2+作用時間的延長而增加影響力度。

3 結論與討論

生物監測是理化監測的重要補充，用生物監測進行配合，充分利用指示生物對污染物毒性反應的敏感性，便能較準確地反映真實的污染狀況[10]。菱形藻為污水藻，本試驗對象選取菱形藻屬中的Nitzschia amplectens，該種生物對重金屬響應的報道極少，而它又是中國西南河流中常見的硅藻種。因此，希望通過本試驗可以提供一些科學數據。在預試驗培養時使用f/2培養基、土壤浸出液以及土壤浸出液和培養基基礎液混合液作為培養基，經觀察得出使用土壤浸出液與培養基礎液按一定比例混合后用作培養基中的藻數量增長最快，藻的運動情況較好，因此，將其作為本試驗中Nitzschia amplectens的培養基。將通過分離和純化培養得到純種Nitzschia amplectens用于不同濃度的Cd2+藻液中進行急性毒性試驗和亞急性毒性脅迫培養試驗，測定96 h EC50、葉綠素a含量及其運動的平均速度，并對這些測定數據進行分析。藻液中的Cd2+濃度與對該藻生長呈負相關關系，且隨著時間的延長，特別是亞急性毒性脅迫培養試驗5 d后，Cd2+濃度對該藻的葉綠素a含量及運動狀況的影響程度明顯逐漸增強，該反應可用于水環境的檢測。

目前，國內外已對多種硅藻受單一重金屬脅迫的影響進行了大量研究[11]，將20世紀90 年代之后微藻受單一重金屬脅迫的LC50或EC50值進行總結，但尚未見Nitzschia amplect的EC50研究報道。若對比該藻種在Cd2+脅迫培養與其他硅藻[如三角褐指藻（Pheodactylum tricornutum）、新月菱形藻Nitzschia closterium等]的96 h EC50值，其值明顯較大[12]，說明Nitzschia amplectens對Cd2+耐受程度較弱，對Cd2+濃度變化反應敏感，可用于監測水體中的重金屬Cd2+含量。

一般情況下，重金屬對藻類生理、生化功能的影響主要表現在抑制光合作用、減少細胞色素、導致畸變以及改變天然環境中藻類的組成。此外，有關藻類的DNA、RNA、蛋白質合成及酶活性等方面也有報道[13]。本試驗對Nitzschia amplectens在 15 d 內進行不同濃度Cd2+亞急性毒性脅迫培養，結果顯示，藻的葉綠素a含量的增加受到明顯抑制。邱昌恩研究發現，重金屬離子能通過阻礙光合作用電子傳遞，抻串4蛋白質合成，對藻細胞線粒體形成損傷使葉綠體變形[14]，如葉綠體收縮、類囊體膨脹、基粒結構解體、基質減少、質體小球大量增加等現象[15-16]，從而降低了藻細胞中的葉綠素a的含量。藻細胞生存生長的能量來源于光合作用，而光合作用發生在葉綠體片層中。類囊體膜上含有各種光臺色素，光合片層基質中含有光合作用暗反應所需的酶系統，光合片層受損，意味著光合作用酶系統受到影響，能量轉化無法順暢完成，導致細胞生長受到影響，從而必定會影響藻的運動。

通過多次試驗觀察發現，在09：00—10：00期間，Nitzschia amplectens 最活躍，因此將試驗情況觀察時間定在這一時段。Cd2+濃度為4.989、2.495 mg/L時，所有藻停止運動，因此Cd2+濃度最高點設定在2.495 mg/L。通過觀測運動情況發現，Cd2+對Nitzschia amplectens運動速度有很大的影響，可能是胞外蛋白聚糖（EPS）與硅藻運動有關[17-18]。今后可以深入開展Nitzschia amplectens胞外產物與運動情況相關的試驗。

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