DNA條形碼技術在病原真菌分類鑒定中的應用

劉娜　李夢臻

摘要：病原真菌是一種具有致病性的真菌，對植物有極大的危害。DNA條形碼技術是通過對足夠變異、短、能夠作為標準目的基因的DNA序列進行分析，并進一步對未知物種進行快速、高效地分類和鑒定或者發現新物種的一項新技術。在介紹DNA條形碼技術概況的基礎上，對DNA條形碼技術在病原真菌分類鑒定中的應用前景進行展望，以推進我國病原真菌DNA條形碼在相關研究和應用領域的發展。

關鍵詞：DNA條形碼；病原真菌；分類鑒定

中圖分類號： Q949.32；S432.4+4 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0010-03

真菌是自然界中一類龐大而廣泛的生物類群，已確認1萬余屬12萬余種[1-2]。病原真菌（Pathogenic fungi）是一種具有致病性的真菌，分布廣泛，尤其在植物中普遍存在，70%～80%的植物病害均由病原真菌引起，對植物造成極大的危害，嚴重影響生態平衡[3]。病原真菌能使花草及農作物的質量受到較大程度損害，產量明顯下降[4]。對物種進行正確的分類鑒定，識別每一個生物體的內部信息，如分類地位、生理生化指標和危害程度等，可以及時采取一定的措施阻止病原真菌危害[5]；因此，病原真菌分類鑒定具有重要意義。

1 病原真菌傳統分類鑒定方法的不足之處

病原真菌的傳統分類和鑒定主要以微觀形態特征、生長特性及生理生化指標為依據，對病原真菌進行形態學、生理及生化特征等分析，并對照已有的研究資料判斷它所處的分類地位以及不同菌株之間的親緣關系。采用傳統分類方法進行病原真菌鑒定費時、耗力、復雜且繁亂[6]，其不足之處具體如下所示。

1.1 病菌形態簡單，分類鑒定較為困難

病原真菌形態簡單，有些菌株僅用形態觀察進行分類鑒定很難，如尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）和串珠鐮孢菌（F. moniliforme）的分生孢子都呈鐮刀狀，兩端漸尖，菌落及顯微形態特征相似，特別是有時培養物不典型或不產孢，僅用傳統方法鑒定更加困難[7]。朱桂寧等對25個病害標樣的12個炭疽病原菌株進行形態觀察和生物學特征研究發現，炭疽病病原菌結構比較單一，傳統生物學特性及致病性基本一致，病原菌形態和生物學特征均無明顯差異[8]。

1.2 病原真菌形態特征易受外界環境影響

病原真菌形態特征易受培養條件和其他因素影響，生長特性和生理生化指標不穩定[9]。如炭疽菌菌絲生長和產孢受溫度、pH值等生態條件和碳源、氮源等營養條件的影響較大[10]。

2 DNA條形碼技術概述及其在病原真菌分類鑒定中的應用

隨著分子生物學技術和一些相關學科的飛速發展以及對DNA序列認識的不斷增加，人們提出利用DNA條形碼進行病原真菌分類鑒定的設想[11]。從遺傳本質探索病原真菌的親緣關系，以DNA條形碼技術替代傳統分類方法進行病原真菌鑒定，為病原真菌的分類鑒定構建了新前景[12]。

2.1 DNA條形碼技術簡介

2003年，Herbert等提出DNA條形碼概念[13]。生命DNA條形碼協會對DNA條形碼的定義是：DNA條形碼為一短段能夠高效鑒定物種的DNA標準區域[14]。DNA條形碼技術通過對2個來自不同生物個體的較短同源DNA序列進行PCR擴增和測序，對序列進行多重比對和聚類分析，將該個體精確定位到一個已描述的分類群中[15]。DNA條形碼技術可準確地辨別形態分類難以區分的病原真菌，任何生長發育時期的任何形態均可使用該技術，是傳統鑒定方法所不能比擬的[16]，且易于構建統一的DNA條形碼數據庫，可一次性快速鑒定大量樣本或者發現新物種[17]，彌補了傳統分類鑒定方法的不足，這為分類學研究提供了標準快速的物種鑒定方法，并逐漸成為病原真菌分類學領域進展最迅速的前沿學科[18]。

DNA條形碼需具備以下特征特性：（1）具有可以區分不同物種的足夠變異性和系統進化信息[19]，同時種間存在明顯的遺傳變異，種間變異超過種內變異[20]；（2）在普遍的分類群中均存在，并且有利于DNA提取和PCR擴增；（3）具有高度保守的區域，便于設計通用引物[21]；（4）包含充分的系統進化信息，便于確認物種的系統地位[22-23]。

2.2 DNA條形碼技術在病原真菌分類鑒定中的應用

DNA條形碼技術利用病原真菌有足夠變異、容易擴增、較短的標準DNA片段對物種進行分類鑒定[24]，其中， CO1和ITS等已被提出較適合作為備選片段[25]。

2.2.1 CO1線粒體DNA細胞色素氧化酶亞基Ⅰ在病原真菌中的應用 2003—2004年，已有少量學者使用CO1對真菌進行研究[26]。有研究發現，利用病原真菌CO1一段長度為648 bp（5末端開始第58～705位）的基因片斷，能夠在DNA水平上成功地將物種進行分類[27]，這被認為是每種生物都具有的獨一無二的DNA條形碼編碼理想區域[28]。CO1序列擁有更多的系統發育信號，更適合于分析親緣關系密切的分類類群[29]。Seifert等對青霉屬（Penicillium）的58個物種370余份樣本CO1序列進行擴增，對PCR產物進行分析，發現了4個屬，并認為CO1序列適合作為青霉屬分類鑒定的DNA條形碼[5]。Nguyen等利用菌物的CO1序列進行研究，發現錘舌菌屬（Leohumicola）的3個新種，CO1序列作為該類群有效的物種分類鑒定條碼，可以發現菌物的隱藏種和新種[30]。Martin對疫霉屬（Phytophtora spp.）CO1和CO11基因進行研究發現，利用CO1和CO11基因相結合對物種進行分類鑒定，比單一考慮ITS序列更加穩定可靠[31]。

2.2.2 ITS 核糖體轉錄間隔區在病原真菌分類鑒定中的應用 轉錄間隔區是位于18S rDNA和5.8S rDNA之間及5.8S rDNA和28S rDNA之間的區域片段[9]，是目前真菌物種分辨率最高的單一DNA片段。該基因片段雖然較短，但人們可以從不太長的序列中獲得足夠的信息，有更高的PCR擴增成功率，進行測序和克隆也比較容易[32]。種內的不同菌株之間高度保守，但在種間變化極大，近緣的種屬也能夠通過ITS序列上的不同而加以鑒別。Landeweert等認為，真菌通過ITS區域比對，序列相似性小于95%，鑒別為同科；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為同屬；序列相似性大于99%，鑒別為同種[33]。沒有一種單一線粒體基因在病原真菌分類鑒定上比ITS基因更加合適[34]。

段維軍等對輪枝菌的ITS片段進行研究，成功區分了所涉及的10個種，ITS序列是輪枝菌理想的DNA條形碼，能對物種或未知菌進行準確分類鑒定[35]。Bryn等通過ITS序列對傘菌亞門（Agaricomycotina） 進行研究，發現ITS基因比CO1基因更適合作為該類群的DNA條形碼[36]。Boyanton等對60株念珠菌屬（Candida）進行ITS2序列擴增，并進行菌種分類鑒定，檢測出8種不同菌株，其結果與生化檢測和形態學鑒定結果一致，且所用時間均比兩者短[37]。Sert等利用ITS序列和18S rDNA片段，對古代大理石紀念碑中的250個黑色真菌樣品進行研究，發現其中有99種不同的真菌菌株，它們全都是子囊菌的新種[38]，利用DNA條形碼技術對物種進行分類鑒定，不受物種生長時期的限制。Feau等對8個不同的柵銹菌（Melampsora）物種的形態學特征和DNA條形碼進行比較，糾正加拿大標本館的錯誤定名，證明Melampsora aecidioides與柵銹菌屬的其他4個種密切相關但不相同[39]。李依韋等應用ITS序列進行腐霉菌（Pythium）的分子鑒定及菌群之間的系統發育分析，從形態學角度對腐霉菌的分類起到了修正和補充的作用[40]。

3 展望

目前，病原真菌的分類鑒定方法多種多樣。依據病原真菌的形態特征、生長特性以及生理生化指標進行分類鑒定的傳統方法，由于受到許多客觀因素影響，測定指標往往不穩定，給病原真菌的分類鑒定帶來嚴峻挑戰。隨著分子生物學的飛速發展和不斷成熟，一種高效的標準化分子生物學鑒定體系——DNA條形碼技術應運而生[41-42]。DNA條形碼技術為探測未知物種和識別病原菌提供了大量數據，成為闡明宿主寄生和共生關系的一種有效的工具[43]。需要說明的是，DNA條形碼技術也有一定的局限性，適用于所有物種的DNA條形碼是基本不存在的，在對不同物種類群進行分類鑒別時需要用不同的目的基因[14]。DNA條形碼技術是傳統鑒定方法強有力的補充，有著其他方法不可比擬的優勢，已在病原真菌的研究中得到廣泛應用，已經成為病原真菌分類鑒定的有力工具，解決了許多重要的生物問題，為國家經濟和生態環境建設、生物多樣性維護、生物安全保障、物種保護等科學領域開辟了一個新的方向[24]。

參考文獻：

[1]楊祝良. 基因組學時代的真菌分類學：機遇與挑戰[J]. 菌物學報，2013，32（6）：931-946.

[2]吳紹熙，郭寧如. 真菌的分子生物學[J]. 中國真菌學雜志，2007，2（4）：231-239，242.

[3]高 山，王孟飛，胡 平，等. 基于ITS序列對萬壽菊葉斑病病原菌的分子鑒定[J]. 湖北農業科學，2013，52（9）：2074-2076.

[4]李 斌，盛 鷗，李春雨，等. 香蕉枯萎病病原菌的研究進展[J]. 分子植物育種，2013，11（5）：638-646.

[5]Seifert K A，Samson R A，Dewaard J R，et al. Prospects for fungus identification using CO1 DNA barcodes，with Penicillium as a test case[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104（10）：3901-3906.

[6]吳清平，黃龍花，楊小兵，等. 核酸序列分析在真菌分類鑒定中的應用[J]. 中國衛生檢驗雜志，2009，19（4）：959-961.

[7]鄭雪芳，藍江林，曹 宜，等. 瓜類作物枯萎病病原菌的分類鑒定及其ITS序列差異性分析[J]. 中國農業科學，2008，41（12）：4077-4084.

[8]朱桂寧，蔡健和，胡春錦，等. 廣西山藥炭疽病病原菌的鑒定與ITS序列分析[J]. 植物病理學報，2007，37（6）：572-577.

[9]白樹猛，田 黎. ITS序列分析在真菌分類鑒定和分子檢測中的應用[J]. 畜牧與飼料科學，2009，30（1）：52-53，189.

[10]齊慧霞，李雙民，余金詠，等. 八仙花炭疽病病原菌鑒定及其生物學特性[J]. 經濟林研究，2008，26（3）：84-87.

[11]Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L，et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Biological Sciences，2003，270（1512）：313-321.

[12]李立平，羅玉萍，李思光. 真菌非編碼RNA[J]. 微生物學報，2013，53（8）：790-797.

[13]武宇鵬，丁 亮，李 捷，等. DNA條形碼的應用進展及討論[J]. 環境昆蟲學報，2011，33（1）：99-106.

[14]楊耀華. DNA條形碼技術的應用進展[J]. 中國醫藥指南，2013，11（17）：484-485.

[15]Gregory T R. DNA barcoding does not compete with taxonomy[J]. Nature，2005，434：1067.

[16]Velmurugan S，Prasannakumar C，Manokaran S，et al. DNA barcodes for marine fungal identification and discovery[J]. Fungal Ecology，2013，6（5）：408-418.

[17]周均亮，趙瑞琳. 真菌DNA條形碼技術研究進展[J]. 微生物學通報，2013，40（8）：1468-1477.

[18]馬 英，魯 亮. DNA條形碼技術[J]. 中國媒介生物學及控制雜志，2012，23（3）：185-190，205.

[19]Stoeckle M Y，Hebert P N. Bar code of Life：DNA tags help classify animals[J]. Scientific American，2008，299（4）：82-88.

[20]Schoch C L，Seifert K A，Huhndorf S，et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer（ITS） region as a universal DNA barcode marker for fungi[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（16）：6241-6246.

[21]Eberhardt U. A constructive step towards selecting a DNA barcode for fungi[J]. New Phytologist，2010，187（2）：266-268.

[22]劉淑艷，張 傲，李 玉. 菌物DNA條形碼技術的研究進展[J]. 華中農業大學學報，2012，31（1）：121-126.

[23]Kress W J，Wurdack K J，Zimmer E A，et al. Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（23）：8369-8374.

[24]陳士林，龐曉慧，羅 焜，等. 生物資源的DNA條形碼技術[J]. 生命科學，2013，25（5）：459-466.

[25]閆化學，于 杰. DNA條形碼技術在植物中的研究現狀[J]. 植物學報，2010，45（1）：102-108.

[26]Seifert K A. Progress towards DNA barcoding of fungi[J]. Molecular Ecology Resources，2009，9（1）：83-89.

[27]Min X J，Hickey D A. Assessing the effect of varying sequence length on DNA barcoding of fungi[J]. Molecular Ecology Notes，2007，7（3）：365-373.

[28]王 穎，方紹慶，劉明杰，等. DNA條形碼技術在媒介蠅類分子鑒定中的應用[J]. 口岸衛生控制，2013，18（3）：55-58.

[29]焦明超，趙大顯，歐陽珊，等. DNA條形碼技術在生物分類學中的應用前景[J]. 湖北農業科學，2011，50（5）：886-890.

[30]Nguyen H D T，Seifert K A. Description and DNA barcoding of three new species of Leohumicola from South Africa and the United States[J]. Persoonia，2008，21：57-69.

[31]Martin F N，Tooley P W. Phylogenetic relationship among Phytophthora species inferred from sequence analysis of mitochondrial encoded cytochrome oxidase Ⅰ and Ⅱ genes[J]. Mycologia，2003，95（2）：269-284.

[32]Li H C，Bouchara J P，Hsu M M，et al. Identification of dermatophytes by an oligonucleotide array[J]. Journal of Clinical Microbiology，2007，45（10）：3160-3166.

[33]Landeweert R，Leeflang P，Kuyper T W，et al. Molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons[J]. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（1）：327-333.

[34]Vialle A，Feau N，Allaire M，et al. Evaluation of mitochondrial genes as DNA barcode for Basidiomycota[J]. Molecular Ecology Resources，2009，9（1）：99-113.

[35]段維軍，張慧麗，郭立新，等. ITS片段作為輪枝菌DNA條形碼的評價研究[J]. 植物保護，2013，39（4）：72-77，89.

[36]Bryn T M D，Maryna Y D，Jean-Marc M. Comparing CO1 and ITS as DNA barcode markers for mushrooms and allies（Agaricomycotina）[J]. Plos One，2011，6（9）：e25081.

[37]Boyanton B L，Luna R A，Fasciano L R，et al. DNA pyrosequencing based identification of pathogenic Candida species by using the internal transcribed spacer 2 region[J]. Archives of Pathology & Laboratory Medicine，2008，132（4）：667-674.

[38]Sert H B，Sümbül H，Sterflinger K. Microcolonial fungi from antique marbles in Perge/Side/Termessos （Antalya/Turkey）[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2007，91（3）：217-227.

[39]Feau N，Vialle A，Allaire M，et al. Fungal pathogen （mis—） identifications：a case study with DNA barcodes on Melampsora rusts of aspen and white poplar[J]. Mycological Research，2009，113（6/7）：713-724.

[40]李依韋，銀 玲. rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌分類鑒定中的應用[J]. 內蒙古民族大學學報：自然科學版，2012，27（1）：66-67.

[41]陳亞輝，朱海軍，生靜雅，等. DNA條形碼序列對不同品種美國山核桃的鑒定[J]. 江蘇農業學報，2013，29（6）：1445-1450.

[42]崔志偉，王康才，鄭 暉，等. DNA條形碼序列對不同品種金銀花的鑒定[J]. 江蘇農業科學，2013，41（8）：43-45.

[43]Frzal L，Leblois R. Four years of DNA barcoding：current advances and prospects[J]. Infection，Genetics and Evolution，2008，8：727-736.