暗紫貝母鱗莖的組織培養

張振霞　張惠婷　龐立志等

摘要：由于不合理的采挖，暗紫貝母野生資源奇缺，而植物組織培養技術不僅可以有效地保存暗紫貝母種質資源，而且可以解決人工種植的種苗問題。以暗紫貝母鱗莖為外植體，通過選擇流水沖洗時間和消毒時間，研究不同激素組合對不定芽的誘導效果以及誘發產生不定芽或不定根從而長成完整的植株的過程，以期建立暗紫貝母的快速無性繁殖體系。結果表明，以暗紫貝母鱗莖為外植體，先用流水沖洗3 h，經75%乙醇表面消毒后，用0.10%氯化汞處理8 min，最后用無菌水清洗5次的效果最佳，污染率僅為7.5%；不定芽誘導的最佳培養基配方是MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，誘導率達66.7%；最佳繼代培養基配方同不定芽誘導，增殖系數可達8.27；在1/2MS+0.5 mg/L NAA的培養基上的生根情況較好。

關鍵詞：暗紫貝母；組織培養；培養基配方；鱗莖；不定芽；誘導；增殖；生根

中圖分類號： Q945.51 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0017-03

暗紫貝母（Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia）為著名中藥材川貝的主要來源之一，入藥部位為地下鱗莖，具有清熱潤肺、化痰止咳的功效[1]。暗紫貝母喜寒涼氣候，主要分布于四川省阿壩地區的海拔較高的高原與草地，生長環境特殊，人工引種栽培有很多困難。另外，暗紫貝母生長周期長，一般4～5年才可采收，而且產量很低，因此目前暗紫貝母的資源比較短缺，很大程度上都依賴于野生資源。經過多年采挖，暗紫貝母的野生資源破壞嚴重，產量逐年減少，貨源緊缺，價格逐年攀升，因此尋找新的途徑以解決其資源問題是非常迫切的。植物組織培養技術可以從根本上解決暗紫貝母的苗種問題，成本低，見效快；此外，可以研究組培出來的暗紫貝母愈傷組織的藥效，有可能成為有效的替代技術。因此，暗紫貝母組培技術的研究在藥用植物開發研究和生產中具有特殊的意義和應用潛力[2]，本研究探討不同植物激素組合對暗紫貝母鱗莖不定芽誘導、增殖、生根情況的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

暗紫貝母地下鱗莖于2012年6月采自四川省康定地區。

以MS為基本培養基，附加30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂，調節pH值為5.8，添加不同濃度2，4-D、NAA、6-BA等激素。所有培養基均在121 ℃條件下高壓滅菌15 min。

培養條件為溫度（25±1） ℃、空氣相對濕度50%～60%、光照時間12 h/d、光照度1 000～1 500 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的消毒 選取白嫩、健康的新鮮貝母地下鱗莖，用自來水沖洗1～2 h，置于超凈工作臺上用75%乙醇進行表面消毒，采用5種方式對鱗莖外植體進行消毒處理，分別為：處理1：流水沖洗1 h+70%乙醇處理30 s+0.05%氯化汞浸泡、振蕩 8 min；處理2：流水沖洗1 h+70%乙醇處理30 s+0.10%氯化汞浸泡、振蕩 8 min；處理3：流水沖洗1 h+70%乙醇處理30 s+10%次氯酸鈉浸泡、振蕩 20 min；處理4：流水沖洗3 h+70%乙醇處理30 s+0.10%氯化汞浸泡、振蕩 8 min；處理5：流水沖洗3 h+70%乙醇處理30 s+0.10%氯化汞浸泡、振蕩 10 min。消毒后用無菌水清洗5次后接種于附加不同激素組合的MS培養基中進行培養，接種2周后統計污染率，以期篩選出適合的滅菌方式。

1.2.2 不同激素組合對暗紫貝母鱗莖誘導的比較 選用當年生鱗莖作為外植體，將其切成0.5 cm大小、厚度0.2 cm左右，置于含NAA（0.5、2.0 mg/L）、6-BA（0.5、2.0 mg/L）、2，4-D（2.0 mg/L）、KT（1.0 mg/L）、TDZ（1.0 mg/L）的不同種類與濃度植物激素組合的MS培養基上，培養周期為30 d，通過統計和對比誘導效率以及生長狀況，研究不同激素種類與濃度組合對暗紫貝母鱗莖誘導的影響。

1.2.3 繼代培養的選擇 選用鱗莖誘導出的不定芽，轉移到含有NAA（0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L）的MS培養基中，每種培養基30塊，培養30 d后觀察記錄，比較NAA、6-BA對其繼代生長的影響。

1.2.4 暗紫貝母鱗莖誘導生根培養 選取生長較一致且健壯、未生根的綠色鱗芽單株，轉入含NAA（0.5、2.0 mg/L）、IBA（0.5 mg/L）、6-BA（0.5、2.0 mg/L）、KT（1.0 mg/L）、TDZ（1.0 mgl/L）的1/2MS、MS生根培養基中，培養30 d后統計生根數、出根率。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌方法對暗紫貝母鱗莖消毒的效果

由于暗紫貝母的地下鱗莖帶菌嚴重，本研究采用不同的消毒方法對暗紫貝母鱗莖進行了滅菌，2周后比較染菌率及存活狀態。從表1可以看出，處理4、處理5的滅菌效果比較好，但是從染菌率和暗紫貝母鱗莖存活狀態明顯可以看出，方法4更適合于暗紫貝母鱗莖器官的表面滅菌。因此認為流水沖洗3 h、0.1%氯化汞滅菌8 min、無菌水清洗5次方法的滅菌效果最佳。

2.2 不同激素組合對暗紫貝母地下鱗莖誘導的影響

暗紫貝母鱗莖切片成大小為0.5 cm、厚度為0.2 cm左右，接種在含有不同植物激素的MS誘導培養基上，培養20 d左右發現從貝母外植體切塊四周逐漸分化出小的不定芽，30 d 后統計不定芽誘導率，詳見圖1。由表2結果可知，培養基中不同組合配比的植物激素對鱗莖的誘導效率不同：在含高濃度生長素的培養基上，發現NAA、2，4-D對于貝母鱗莖誘導都有明顯的促進作用，其中MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA 的出芽率達43.7%，且新生芽長勢旺盛，數量多，較健壯，狀態佳。在2.0 mg/L 6-BA的培養基上，鱗莖外植體也誘導出不少的新生芽，只是芽較細小。在此基礎上各添加 1.0 mg/L KT或TDZ，對新生芽的誘導促進作用并不明顯，但是個別外植體長出淺黃色的根狀物；在含KT的培養基上，幾個新生芽變成綠色。綜合上述研究結果可知，選擇 MS附加2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA作為暗紫貝母鱗莖誘導芽的較優激素組合培養基。

2.3 不定芽的繼代培養

將暗紫貝母鱗莖誘導分化出的不定芽轉移到含有不同濃度組合NAA、6-BA的MS培養基中，每種培養基接種30個，培養10 d后就發現在外植體塊上長出不少新芽（圖2）。35 d 后統計芽數，從表3可以看出：在不定芽繼代培養中，6-BA 和NAA的不同組合在一定程度上都能促進暗紫貝母鱗莖不定芽的增殖，且隨著植物激素濃度的上升，增殖系數也提高；但是當NAA、6-BA分別達到3.0 mg/L時，培養的不定芽出現一定程度的玻璃化現象，可見植物激素能促進誘導貝母鱗莖生長，但是使用濃度不能太高。最終選定2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為最佳的繼代培養基激素組合，此條件下新生芽旺盛，增殖系數為8.27。

2.4 生根培養

本試驗將以分化再生暗紫貝母鱗莖轉入到不同的生根培養基中，培養30 d后觀察生根結果，詳見表4、圖3。在貝母鱗莖誘導增殖的培養過程中，MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA培養基上添加1.0 mg/L KT或1.0 mg/L TDZ，培養一段時間后發現鱗莖外植體周圍長出許多鵝黃色、長短粗細各異的不定根，可見貝母鱗莖生根相對容易。而在1/2MS生根培養基中，NAA和IBA的存在有利于生根，特別是在含 0.5 mg/L NAA的培養基中，培養10d后就長出健壯的根，約83.3%的鱗莖生根密集，長勢好。在1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA和1/2MS+0.5 mg/L IBA的培養基中，生根效果也較好。綜合比較可知，貝母鱗莖生根對培養成分的要求不高，試驗過程中基本都能生根，但1/2MS+0.5 mg/L NAA的培養基上生根率最高，長出的根更加健壯，生根速率也快。生根后鱗莖長出的綠芽見圖4。

3 結論與討論

3.1 不同消毒方法的除菌效果

貝母地下鱗莖帶菌嚴重，通常的消毒方法往往難以取得滿意的效果。已有研究多數是用傳統的滅菌方法[3-5]，基本是采用70%的乙醇浸泡30 s，再用0.1%～0.2%的HgCl2處理5～8 min，最后用無菌水漂洗5～8次。本研究采用上述方法，但消毒效果都不甚理想，這主要由于貝母鱗莖通常都是 2～3 枚鱗葉相互合抱，加劇了外植體消毒處理的難度。而調整之后的消毒方法則取得不錯的結果：將貝母地下鱗莖先用流水沖洗3 h以上，經75%乙醇表面消毒后，再用 0.10%氯化汞振蕩8 min消毒處理，最后用無菌水清洗5次，獲得外植體的污染率為7.5%，同時且消毒劑對外植體生長的影響也較小。

3.2 不同激素配比對暗紫貝母鱗莖誘導增殖的影響

不定芽的產生主要取決于培養基的類型及植物激素種類與濃度的配比組合。李隆云等通過對暗紫貝母鱗莖再生組織培養技術的研究指出，NAA和KT的組合有利于鱗莖的誘導[3]。王躍華等認為，2.0 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA組合為卷葉貝母鱗莖再生最佳條件[4]。高燕等研究發現，誘導不定芽的最佳培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D[5]。劉亞菊等研究了TDZ在平貝母組織培養中的作用，結果表明，TDZ在濃度很低時可刺激平貝母外植體脫分化和再分化[6]。選用NAA、6-BA、KT、TDZ、2，4-D這5種激素不同組合誘導出不定芽，結果表明，2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA組合誘導不定芽的生長效果較好，同樣的培養基條件在繼代培養中的增殖系數為8.27，效果也最佳。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：化學工業出版社，2005.

[2]耿茂林，馬 琳，常 莉，等. 貝母組織培養研究進展[J]. 淮北煤炭師范學院學報：自然科學版，2007，28（1）：38-42.

[3]李隆云，周裕書，代 敏，等. 暗紫貝母鱗莖再生組織培養技術研究[J]. 中國中藥雜志，1995，20（2）：78-80.

[4]王躍華，代 勇，何宗晟，等. 離體培養條件對卷葉貝母鱗莖再生的影響[J]. 中藥材，2010，33（6）：854-856.

[5]高 燕，賀 賓，范 弢，等. 貝母愈傷組織的誘導及植株再生[J]. 新疆農業科學，2005，42（1）：35-37.

[6]劉亞菊，殷 紅，朱四易. 噻二唑苯基脲在平貝母組織培養中的作用[J]. 西北大學學報：自然科學版，2000，30（2）：139-142.