核受體依賴的膽汁酸信號調控硬化肝肝再生的研究

郝晉齊 莫春林

核受體依賴的膽汁酸信號調控硬化肝肝再生的研究

郝晉齊 莫春林

目的 探討核受體依賴的膽汁酸信號在硬化肝肝再生中的作用。方法 根據實踐經驗制備60只肝硬化SD大鼠肝部分切除模型，將其平均分為3組（n=20），A組使用普通飼料喂養，B組使用0.2%膽酸飼料喂養，C組使用2%消膽胺飼料喂養，持續喂養5d后，檢測比較3組大鼠膽汁分泌速度、肝功能指標、肝細胞有絲分裂指數、肝細胞增殖細胞核抗原和細胞核DNA含量，比較分析3組大鼠肝組織核受體的mRNA表達情況。結果 B組膽汁分泌速度、總膽汁酸含量、血清白蛋白、肝細胞有絲分裂指數、細胞核DNA含量均顯著高于A組，C組的上述各項指標顯著低于A組和B組，上述差異比較均具有統計學意義（P＜0.05）；B組的肝組織核受體mRNA表達量顯著高于A組，C組的肝組織核受體mRNA表達量顯著低于A組和B組，差異比較均具有統計學意義（P＜0.05）。結論 核受體依賴的膽汁酸信號對硬化肝肝再生的調控作用非常關鍵，膽汁酸的增加利于肝組織再生。

核受體依賴；膽汁酸；肝硬化；肝再生

肝癌是致死率較高的惡性腫瘤，僅次于胃癌和食道癌，臨床研究指出我國的肝癌患者4/5以上存在肝硬化[1]，為了延長生存周期，患者選擇肝切除手術，但術后肝組織的再生能力受阻，肝臟功能代償問題成為目前研究的臨床熱點。若代償良好，患者會逐漸恢復，但如果代償不佳，肝功能會隨之衰竭，最終死亡。如何避免肝切除術后肝組織再生的缺失、促進肝功能恢復，對術后生存有著重要臨床意義。肝再生是細胞、基因、信號等眾因素作用調控過程，核受體參與編碼轉錄因子的超基因家族，參與生理活動調節[2]。本研究探討核受體依賴的膽汁酸新號在硬化肝肝再生中的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物模型的制備 選用雄性60只SD大鼠，體質量100～180g，平均體質量（152.6±26.8）g，根據實踐經驗進行動物模型制作，飲用0.03%硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）溶液12周來復制肝硬化模型。肝硬化大鼠肝部分切除術模型制備：肝硬化大鼠8%水合氯醛腹腔麻醉(40μg/g)后，切除大鼠肝左葉。

1.2 實驗分組 60只肝硬化部分切除術模型完成后進行數字隨機化平均分為3組，3組大鼠的體質量比較無顯著差異。A組20只使用普通飼料進行喂養，B組20只使用0.2%膽酸飼料喂養，C組20只使用2%消膽胺飼料喂養，連續喂養5d。

1.3 檢測指標及方法 膽汁分泌速度：SD大鼠麻醉后嚴格無菌條件下實施剖腹術，分離膽總管后用1小聚乙烯導管(22G)插管，收集膽汁30min以測定膽汁分泌的速度。

膽汁酸含量：取一定量肝，80℃烘干后，研磨成粉末。用無水乙醇70℃提取3次，提取液80℃蒸干，用石油醚去除脂肪和中性膽固醇，剩余沉淀用含2% Triton X-100的乙醇溶解，再80℃蒸干，最后用蒸餾水溶解沉淀，此液即為提取的肝膽汁酸溶液。用全自動生化分析儀酶法測定總膽汁酸，以每克肝中含有膽汁酸的微摩爾數表示肝膽汁酸含量(μmol/g)。

肝功能：全自動生化分析儀酶法測定白蛋白和丙氨酸氨基轉移酶。

肝細胞有絲分裂指數：病理切片行常規染色，有絲分裂肝細胞在1000個干細胞中的比例。

細胞核DNA含量：將大鼠肝臟組織切片行Feulgen法染色后，應用全自動圖像分析儀，隨機選擇3～4個視野，每張切片測定肝細胞150個左右，定位待測肝細胞核，由電視攝像系統提取數字化的細胞核圖像，測定細胞核面積，積分光密度，計算出肝細胞U值(DNA相對含量)，經微機處理后，確定DNA倍型。

核受體mRNA：采用異硫氰酸胍一步法提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度法鑒定RNA的量和純度，以逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(reverse transcriptasepolymerase chain reaction,RT-PCR)法對mRNA進行半定量分析。

1.4 統計學方法 對本組研究的數據采用SPSS17.0統計軟件進行分析。正態計量資料采用“±s”表示；2組正態計量數據的組間比較采用t檢驗以；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝再生相關指標檢測結果 B組膽汁分泌速度、總膽汁酸含量、血清白蛋白、肝細胞有絲分裂指數、細胞核DNA含量均顯著高于A組（tB-A=15.7，14.8，10.5，27.3，14.5，P＜0.01），C組的上述各項指標顯著低于A組和B組，上述差異比較均具有統計學意義（tC-A=7.2，6.7，7.3，3.2，5.0，P＜0.01；tC-B=31.5，21.6，19.9，29.8，20.9，P＜0.01）。見表1。

表1 3組的肝再生相關指標檢測結果（±s，n=20）

表1 3組的肝再生相關指標檢測結果（±s，n=20）

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2.2 肝組織核受體mRNA檢測結果 B組的肝組織核受體FXR表達量（0.67±0.03）mRNA，顯著高于A組（0.53±0.02）mRNA，C組的肝組織核受體表達量（0.45±0.05）mRNA，顯著低于A組和B組，差異比較均具有統計學意義（tB-A=17.36,tC-A=6.64，tC-B=16.87，P＜0.01）。

3 討論

部分肝臟切除后多數患者的肝組織均難以再生，剩余肝葉恢復至原處水平的所占比例較少[3]。肝再生是由細胞、基因、信號分子等多因素相互作用調整的過程，核受體屬于轉錄因子編碼的超基因家族，可參與多種生理活動的調節。已有報道指出核受體激動劑對肝有絲分裂原的促進效果良好，膽汁酸是與該類受體關系較為密切的信號分子，可以借此來調節多支生理學通路，從而維持膽汁酸和膽固醇內環境穩定[4]。國外學者研究發現核受體依賴膽汁酸信號是肝再生的重要物質，該受體是核受體超家族一員，膽汁酸水平降低和相關核受體缺失均會對肝再生造成影響[5]。

膽汁酸、肝內脂肪堆積、肝炎病毒等因子均會損傷干細胞，在上述肝損傷因子持續作用，肝細胞被細胞外基質替代，進而發展成肝纖維化，最終成為肝硬化。本次研究選擇SD大鼠作為實驗材料，根據實踐經驗對其進行選擇性處理，使其轉化為肝硬化大鼠，通過科學方法將其分組研究，結果提示喂養膽酸的B組大鼠的各項肝再生指標的檢測結果明顯好于喂養普通飼料及消膽胺，該組的肝組織核受體FXRmRNA的表達量均顯著高于A組和C組(P＜0.01)，C組大鼠的mRNA表達量最低。消膽胺是一種較為強效的降膽固醇藥物，它可同腸內膽酸結合，抑制膽汁酸的重吸收，增加其排泄，減少肝臟中的膽酸積累，因此C組膽汁酸分泌速度、總膽汁酸量低于A組、B組(P＜0.01)。研究指出FXR可被膽汁酸激活，對肝臟代謝具有重要作用，FXR可同膽汁酸直接結合，作為受體來調控參與膽汁酸代謝基因表達，從而維持膽汁酸內環境穩定[6-7]。FXR調節膽汁酸的具體過程如下：抑制膽汁酸合成的限速酶膽固醇7α羥化酶基因表達，減少膽汁酸的合成；激活肝細胞膜膽鹽輸出泵轉錄，促使膽汁酸向膽小管轉運；調節肝臟牛磺酸鈉協同轉運蛋白表達，減少肝臟對膽汁重吸收；上調回腸膽汁酸結合蛋白轉錄，增加腸道對膽汁酸重吸收[8]。由此可以分析得出膽汁酸分泌量對肝再生的影響效果顯著，對臨床治療肝硬化具有重要的指導價值。FXR在膽汁酸、脂類新陳代謝發揮重要作用，其對肝臟毒性損傷所致肝纖維化提供治療新思路，如合成FXR配體來活化FXR就可能逆轉肝纖維化，緩解肝纖維化癥狀。

綜上所述，核受體依賴的膽汁酸信號對硬化肝肝再生的調控作用非常關鍵，膽汁酸的增加利于肝組織再生。

[1] 羅時敏，譚衛民，鄧偉雄，等.法尼酯X受體在肝硬化大鼠肝切除術后肝再生中的作用[J].中華生物醫學工程雜志，2010，16(2):131-135.

[2] 孟強,劉克辛.核受體FXR在肝再生中的作用[J].世界華人消化雜志，2013，21（34）：3767-3774.

[3] Chen WD,Wang YD,Meng Z,et al.Nuclear bile acid receptor FXR in the hepatic regeneration[J].Biochimica et biophysica acta,2011,1812(8)：888-892.

[4] 孫增鵬，彭創，汪新天，等.膽汁酸與肝再生的臨床研究進展[J].心理醫生雜志，2012,22(10):632-633.

[5] 于昊,崔云甫.FXR促進肝臟再生作用的研究進展[J].世界華人消化雜志,2012，20(23):2173-2177.

[6] Fernández-Barrena MG,Monte MJ,Latasa M,et al.Lack of Abcc3 expression impairs bile-acid induced liver growth and delays hepatic regeneration after partial hepatectomy in mice[J].Journal of Hepatology，2012,56(2)：367-373.

[7] 展翰翔，張太平，趙玉沛.核受體FXR在膽汁代謝相關臟器疾病中的調控機制及研究進展[J].國際外科學雜志,2010,37(11):777-780.

[8] 魯育民.膽汁酸核受體FXR與肝再生[J].現代醫藥衛生，2012, 28(23)：3594-3595.

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.6.009

項目資助：佛山市科學技術局（ 201208309）

廣東 528100 廣東省佛山市三水區人民醫院普外科 （郝晉齊莫春林）