HnRNP LRNP L蛋白在人前列腺癌組織中的表達及其臨床意義*

束方鵬周 僉呂道均雷 斌周許敏毛向明**. 南方醫科大學南方醫院泌尿外科（廣東廣州 5055）; . 江西省豐城市中醫院

HnRNP LRNP L蛋白在人前列腺癌組織中的表達及其臨床意義*

束方鵬1周 僉2呂道均1雷 斌1周許敏1毛向明1**
1. 南方醫科大學南方醫院泌尿外科（廣東廣州 510515）; 2. 江西省豐城市中醫院

摘要目的 研究hnRNP L蛋白在前列腺癌中的表達及臨床意義。方法 收集我院2011年1月至2013年5月期間行前列腺癌根治術后標本60例，良性前列腺增生（BPH）組織標本40例。采用Western blot及免疫組化法檢測hnRNP L蛋白在前列腺癌及良性前列腺增生組織中的表達，并分析其表達與臨床病理參數之間的關系。結果Western blot結果顯示hnRNP L蛋白在前列腺癌組織中的表達明顯高于良性前列腺增生組織（P＜0.05）。免疫組化結果表明hnRNP L蛋白陽性表達于細胞核，其在前列腺癌及前列腺增生組織中的陽性表達率分別為66.7%、17.5%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。此外，hnRNP L在前列腺癌組織中的表達與T分期、臨床分期以及Gleason評分密切相關（P＜0.05）。結論 hnRNP L高表達于前列腺癌組織，與前列腺癌的發生發展存在相關關系，有可能作為前列腺癌早期診斷標志物和治療靶點。

關鍵詞前列腺腫瘤; 核不均一核糖核蛋白L; 免疫組織化學; 蛋白質印跡法

前列腺癌是威脅男性健康的最常見腫瘤之一，在發達國家其發病率居男性腫瘤首位，占全部惡性腫瘤的28%，其死亡率僅次于肺癌[1]。我國前列腺癌的發病率與死亡率雖遠低于歐美國家，但近年來隨著人口老齡化、環境污染和前列腺特異抗原（PSA）篩查的普及，其發病率呈快速上升趨勢，已成為影響男性健康的主要因素[2]。據《北京市2011年健康白皮書》報道，北京市男性前列腺癌發病率由2001年的5.53/10萬上升至2010年的16.62/10萬，9年增長200.5%，年均增長9.2%。另一項針對全國前列腺癌流行病學研究表明：我國前列腺癌發病率呈明顯持續增長趨勢，50歲以上前列腺癌發病率顯著增加[3]。前列腺癌的發病率和死亡率具有明顯的種族差異，我國前列腺癌患者的最大特點是晚期患者多、治療效果較差，究其原因，缺乏縝密的早期篩查、綜合治療不盡規范是關鍵[4]。由于前列腺癌發生存在十分明顯的人種差異，研究中國人群特異性、個體化的前列腺癌發病機制，尋找有效的早期診斷和治療的分子靶標具有重要意義。

目前，前列腺癌的發病機制仍不清楚。而越來越多的證據表明，RNA的選擇性剪接作為一個廣泛存在的生物進程，在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用。其中，核不均一核糖核蛋白家族（hnRNPs）因具有選擇性剪接作用而在腫瘤發生中占據重要位置。核不均一核糖核蛋白L（HnRNP L）作為hnRNPs家族中的一員，近幾年在腫瘤中的研究相繼開展，但是hnRNP L在前列腺癌中的表達情況及其功能研究在國內外尚無公開報道。本實驗通過研究hnRNP L在前列腺癌組織中的表達，探討其與前列腺癌臨床參數的相關性，為前列腺癌早期診斷、治療提供新的理論依據。

材料與方法

一、組織標本

60例新鮮前列腺癌組織及40例前列腺增生組織取自南方醫院2011年1月至2013年5月前列腺癌手術切除標本，均為前列腺腺泡腺癌，患者平均年齡67歲。全部標本根據2010版AJCC-TNM分期：T1期15例；T2期19例；T3期21例；T4期5例，根據 Gleason 評分系統，7分以下34例，8～10分26例。選取同期40例BPH標本作為對照，平均年齡63歲。所有標本均由兩名資深病理醫師診斷證實。取材后，一半組織立即置于液氮中保存，一半置于甲醛中固定。

二、主要試劑

抗人h n R N P L的鼠源單克隆抗體（P L laboratories)，抗人GAPDH的鼠源單克隆抗體（欣博盛生物科技有限公司），鏈素抗生物素-過氧化物酶（SP）免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

三、實驗方法

（一）Western blot

取40mg組織經液氮研磨后加入400 μl RIPA裂解液（50 mmol/LTris，150 mmol/LNaCl，1%TritonX-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，1mmol/ LPMSF），離心后吸取上清液。BCA法測定蛋白濃度后，用RIPA裂解液調整蛋白終濃度為5μg/μL。蛋白與上樣緩沖液混勻經煮沸變性后，取10μl混合液在10%聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE電泳，使用BIO-RAD公司的半干轉印儀將蛋白轉至PVDF膜上。半干法轉膜條件為24V，200mA，30min。5%脫脂牛奶室溫封閉2h，分別加入抗人hnRNP L的鼠源單克隆抗體（1:1000，3%BSA）或抗人GAPDH的鼠源單克隆抗體（1:2000，3% BSA）于4℃孵育過夜。次日，1XTBST漂洗3次，每次5min，再分別加入相應的二抗（1:5000，1% BSA）室溫孵育1h。1XTBST漂洗3次，每次5min，使用ECL發光液進行化學發光。使用CareStreamHealth公司的Image Station4000R PRO成像儀檢測發光信號。最后圖像經“ImageJ2x”軟件定量后，hnRNP L與GAPDH的灰度值比值用作hnRNP L蛋白表達水平的組間比較。

（二）免疫組化

10%福爾馬林固定，石蠟包埋的組織塊被切成2μm厚的石蠟切片，經常規脫蠟和水化后，在檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）煮沸2min進行抗原修復。依次滴加3% H2O2滅活內源性過氧化物酶（室溫下孵育10min）、 正常山羊血清封閉（室溫下孵育30min）、hnRNP L一抗（1:200，4℃過夜）、生物素標記的二抗（室溫下孵育30min）、SP溶液（室溫下孵育10min），最后滴加新鮮配制的DAB進行顯色（5min）。顯微鏡下根據觀察染色情況流水沖洗，終止顯色。蘇木素復染后進行脫水封片。染色表達評分方法根據染色強度和陽性細胞數比例兩項指標進行綜合評判。每張切片隨機選取5個視野（400×）進行評分。染色強度分級評分為：無著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分：棕褐色，3分。陽性細胞數比例分級評分為：0%，0分；1%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；6%～100%，4分。染色評分=染色強度評分+陽性細胞數比例評分，總評分：（-）為0～2分；（+）為3分；（++）為4分；（+++）為5～7分。定義（-）、（+）為低表達，定義（++）、（+++）為高表達。所有切片均由兩名病理醫生進行雙盲閱片。

四、統計分析

實驗結果采用SPSS13.0統計學軟件進行分析。采用配對t檢驗分析前列腺癌和BPH組織中hnRNP L蛋白的表達水平。樣本率的比較采用x2檢驗，P＜0.05（雙側檢驗）為差異有統計學意義。

結 果

一、Western blot blot檢測hnRNP LRNP L蛋白的表達水平

Western blot所得圖像用“ImageJ2x”軟件作灰度值分析，用hnRNP L與GAPDH灰度值的比值表示各樣本中hnRNP L蛋白表達強度，計算出相對表達值。結果顯示前列腺癌組織中hnRNP L蛋白的表達量為0.626±0.190，良性前列腺增生組織為0.255±0.100，兩者比較，差異具有統計學意義（P=0.002，圖1）。

圖1 hnRNP L 蛋白在前列腺癌（C）和良性前列腺增生組織（N）中Western bblloott結果

二、免疫組化檢測HnRNP LRNP L蛋白在前列腺癌及BPH組織中的表達

HnRNPL蛋白主要表達于細胞核內，呈彌漫性分布（見圖2）。HnRNPL蛋白在前列腺癌組織中多數呈陽性表達，陽性表達率為66.7%（40/60）；在良性

PH組織中hnRNP L蛋白顯色的陽性細胞數及顯色強度較前列腺癌組織明顯減少及降低，在少數良性BPH組織中呈陽性表達，陽性表達率為17.5%（7/40），兩者比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

三、hnRNP LRNP L蛋白在前列腺癌中的表達與臨床病理參數的關系

60例前列腺癌組織中，hnRNP L蛋白的表達與T分期、臨床分期及Gleason評分密切相關；其中，T1-T4 期hnRNP L蛋白的陽性表達率分別為46.7 %（7/15）、2.6（10/19）、90.5%（19/20）及80.0%（4/5），組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。Gleason評分≤7分及8～10分的患者中，hnRNP L蛋白的陽性表達率分別為55.9%（19/34）、80.8%（21/26），組間比較差異有顯著性（P＜0.05）。臨床分期為Ⅱ期、Ⅲ期及IV期患者中，hnRNP L蛋白的陽性表達率分別為50.0%（16/32）、82.4%（14/17）、90.9（10/11），組間比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。然而，hnRNP L蛋白表達與患者年齡無明顯相關性（表2）。

討 論

HnRNP L為hnRNPs家族成員，參與染色體重塑、RNA穩定性調節、蛋白質翻譯以及相關信號轉導過程[5-7]。近年來研究表明hnRNP L表達與腫瘤的發生發展密切相關。其中，Yau等[8]研究表明hnRNP L 蛋白高表達于肝癌組織，其表達與腫瘤細胞的生長、遷移及侵襲相關。Goehet等[9]研究表明hnRNP L參與調控肺癌的成瘤能力。D'Agostino等[10]研究表明hnRNP L可能與乳腺癌的發生相關。然而，關于hnRNP L表達是否與前列腺癌的發生發展相關，目前尚缺乏相關研究報道。

圖2 hnRNP L 蛋白在前列腺癌和良性前列腺增生組織中免疫組化染色結果

表1 hnRNP L 在前列腺癌和BBPPHH組織中的表達

表2 前列腺癌中hnRNP LRNP L的表達與相關臨床病理特征的關系

本研究中，我們通過Western blot和免疫組化實驗檢測了hnRNP L在60例前列腺癌及40例良性前列腺增生組織中的表達，結果顯示hnRNP L在前列腺癌中的表達明顯高于前列腺增生，提示hnRNP L表達可能與前列腺癌的發生相關，hnRNP L高表達可能有助于前列腺癌的發生。進一步結合前列腺癌患者的臨床病理資料，我們發現hnRNP L在前列腺癌中的表達與T分期相關，提示hnRNP L與腫瘤的大小相關，hnRNP L高表達可能有助于腫瘤細胞的增殖。同時，hnRNP L表達與臨床分期及Gleason評分呈明顯正相關，提示hnRNP L表達可能與前列腺癌患者的病情進展相關，影響患者的預后，這與hnRNP L在肝癌中的報道較為相符。

hnRNP L是一種RNA結合蛋白，參與染色體重塑、轉錄、翻譯的調控以及信號轉導等多個生物進程[11]，在腫瘤發生發展中的作用值得重視。關于hnRNP L在前列腺癌中的作用機制尚不清楚。目前研究已報道hnRNP L在其它腫瘤中的可能作用機制。其中，Goehet等[9]研究表明hnRNP L通過對caspase-9 Pre-RNA的加工，影響非小細胞肺癌的腫瘤形成。Lee等[12]發現在乳腺癌細胞中，hnRNP L與內源性Bcl-2 mRNA具有相互作用關系。Jafarifar等[13]發現hnRNP L可調控與腫瘤發生發展密切相關的血管內皮生長因子（VEGF-A）。近期有研究表明：hnRNP L 和lncRNA-THRIL可形成功能復合體并與TNFα啟動子區域結合，通過調節Toll受體信號通路中的髓樣分化因子MyD88，達到調控TNFα基因轉錄的作用[14]。HnRNP L已被證實參與細胞凋亡，RNA轉運等生物進程，與腫瘤發生密切相關，然而關于hnRNP L在前列腺癌中的作用機制仍有待于后續的深入研究。

總之，本研究結果顯示hnRNP L蛋白在前列腺癌組織中的表達顯著高于良性前列腺增生組織，且其表達與前列腺癌的T分期、臨床分期及Gleason評分密切相關，提示hnRNP L可能參與了前列腺癌的發生及發展過程，并有望成為臨床前列腺癌早期診斷的標志物和治療靶點。然而，關于hnRNP L在前列腺癌中的生物學功能及其作用機制，仍有待于后續的研究證實。

參 考 文 獻

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11 Han SP, Tang YH, Smith R. Functional diversity of the hnRNPs: past, present and perspectives. Biochem J 2010; 430(3): 379-392

12 Lee DH, Lim MH, Youn DY, et al. hnRNP L binds to CA repeats in the 3'UTR of bcl-2 mRNA. Biochem Biophys Res Commun 2009; 382(3): 583-587

13 Jafarifar F, Yao P, Eswarappa SM, et al. Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNP L. EMBO J 2011; 30(7): 1324-1334

14 Li Z, Chao TC, Chang KY, et al. The long noncoding RNA THRIL regulates TNFα expression through its interaction with hnRNPL. Proc Natl Acad Sci U S A 2014; 111(3): 1002-1007

（2014-12-20收稿）

**通訊作者, E-mail: 13691903635@126.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.003

中圖分類號R 737.25

*基金項目資助: 廣東省科技計劃項目（項目編號：2013B021800147）；深圳市科技計劃項目（項目編號：JCYJ20140415162542992）

Expression of hnRNP L protein in human prostate cancer tissues and its clinical signifi cance*

Shu Fangpeng, Zhou Qian2, Lv Daojun, Lei Bin, Zhou Xuming, Mao Xiangming**
1. Department of Urology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;
2. Traditional Chinese Medicine Hospital, Fengcheng, Jiangxi Province
Corresponding author: Mao Xiangming, E-mail: 13691903635@126.com

AbstractObjective To Investigate the expression of hnRNP L in human prostate cancer and explore its clinical signifi cance. Methodsthods Sixty cases of prostate cancer and 40 cases of benign prostate hyperplasias in our hospital during January, 2011 and May, 2013 were enrolled in this study. The expression of hnRNP L protein in prostate cancer tissues and benign prostate hyperplasias tissues was detected by Western blotting and immunohistochemistry (IHC), respectively. Meanwhile, the correlation between hnRNP L expression and clinical pathological characters was analyzed. Results ults Western blotting analysis showed that hnRNP L expression in prostate cancer tissues was signifi cantly higher than that in in benign prostate hyperplasias tissues (P＜0.05). IHC analysis demonstrated that positive expression of hnRNP L was located in nuclear of cells, and the positive rates of hnRNP L in prostate cancer and benign preostate hyperplasias were 66.7% and 17.5%, respectively, with a signifi cant difference (P＜0.05). Moreover, hnRNP L expression was positively correlated with T stage, clinical stage and Gleason score in prostate cancer (P＜0.05). Conclusionusion hnRNP L is highly expressed in prostate cancer tissues, and correlated with tumor occurrence and development, which may be served as effective molecular marker or therapeutic target in prostate cancer.

Key wordsords prostatic neoplasms; Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein L; immunohistochemistry; Western Blotting