精子纖維鞘發育不良的形態學和遺傳學初步研究（附3例報道）*

王家雄楊慎敏**馬林偉程洪波李海波. 南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心 （蘇州 25002）2. 鹽城衛生職業技術學院

精子纖維鞘發育不良的形態學和遺傳學初步研究（附3例報道）*

王家雄1楊慎敏1**馬林偉2**程洪波1李海波1
1. 南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心 （蘇州 215002）2. 鹽城衛生職業技術學院

摘要目的 分析纖維鞘發育不良患者精子形態學特點，探尋其致病基因。方法 對3例表現為嚴重弱精子癥的患者進行光鏡下精液分析，通過掃描電鏡和透射電鏡進一步明確其超微結構特點。候選基因精子鞭毛蛋白2 （SPEF2）和減數分裂特異性蛋白1（MNS1）全外顯子測序，分析可能的致病突變位點。結果 3例患者均表現為100%（或接近）不活動精子，精子存活率26.0%～80.0%。光鏡和掃描電鏡下可見無尾、粗短尾、卷尾和不規則尾等嚴重畸形，DFS缺陷精子分別占99.5%，97.5%和79.5%。透射電鏡表現為精子鞭毛纖維鞘等多種結構組裝異常，伴有中心微管缺失（59%～78%）和動力蛋白臂缺失。MNS1和SPEF1基因外顯子未見病理性突變。結論 DFS是嚴重弱精子癥原因之一，根據形態學特點可以診斷；遺傳學病因有待研究。

關鍵詞精子/超微結構; 弱精子癥; 鞭毛

按照精液特征不育男性可以診斷為少精子癥、弱精子癥和無精子癥等，隱藏在精液表現下的原發病因復雜多樣。通過標準的評估仍有44%的精液異常原因不明[1]。射出精液中精子均不活動，可能由于獲得性和或天性缺陷精子鞭毛缺陷造成[2]。大多數精子表現為活的但不活動提示精子鞭毛超微結構缺陷[3]。原發性纖毛運動障礙（primary ciliary diskinesia，PCD）是纖毛動力蛋白臂缺失為主的超微結構異常，表現為無活動精子或嚴重弱精子癥，以及反復的呼吸道感染癥狀[4]。

Chemes[5]發現了5名纖維鞘發育不良（dysplasia f the fibrous sheath, DFS）患者，精子95%～100%不活動，光鏡下形態呈短、粗和不規則尾。電鏡下纖維鞘及線粒體等整個鞭毛組裝異常，伴不同程度中心微管及動力蛋白臂缺失[3, 5]。DFS可能為常染色體隱性遺傳，一般發病率低于PCD[3]。DFS在中國人群中僅見個別確診或可疑病例報道，發病率不詳[6-9]。我們最近報道了中國DFS患者，但初步的遺傳學分析未發現致病基因[10]。

目前已經有多種動物基因敲除模型用來研究人類精子鞭毛異常，也為DFS研究提供工具[11]。精子鞭毛蛋白2（sperm flagella protein 2，SPEF2）和減數分裂特異性蛋白1（meiosis-specific nuclear structural rotein 1，MNS1）基因突變小鼠精子表型與人類

FS相似[12,13]，故作為候選基因對3例患者進行測序分析。

資料與方法

一、臨床資料

2012年12月至2014年6月來我院就診的不育男性例，原發不育2～7年。均為漢族，現居蘇州，病例1 和2籍貫蘇州，病例3籍貫山西。精液檢查提示為嚴重弱精子癥及嚴重精子鞭毛畸形。病例1在1歲時有急性肺炎病史以及慢性咳嗽。其余2例否認反復呼吸道感染、鼻竇炎病史，未發現內臟反位情況。生殖系統體格檢查未見異常，染色體核型分析均為正常核型。性激素和精漿抗精子抗體檢測未見異常。生殖系統超聲檢查，睪丸、附睪、精索靜脈、前列腺及精囊均未見特殊病變。病例1的父母為姨表親。患者均簽署知情同意書參與本項研究，并獲得我院倫理委員會通過。

二、精子形態學分析

（一）光鏡下觀察

患者禁欲2～7d手淫取精，在37℃溫箱30min精液液化后，按照世界衛生組織《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版標準進行精液常規分析。存活率試驗采用伊紅-苯胺黑染色，著色精子為死精子。精子形態分析采用改良巴氏染色，計數200個精子尾部，將無尾、粗短尾、卷尾和不規則形記為DFS精子。不規則尾指精子尾部正常結構難以辨認，全部或部分被雜亂結構占據。精液常規和精子形態學分析至少重復兩次。

（二）電鏡觀察

精液液化后，380×g 離心15min，0.1mol/L PBS洗滌2次，離心設定同前。使精子沉淀松散后緩慢加入2.5%戊二醛固定液固定12 h，PBS緩沖液沖洗2次，每次15min，之后經過1%鋨酸后固定1 h，再經過 PBS緩沖液沖洗2次，每次15min，需要觀察表面結構的樣本經過乙醇逐級脫水，100%丙酮和乙酸異戊酯置換后，進行臨界點干燥和離子濺射噴金，最后在掃描電鏡（Stereoscan260, Cambridge, UK）下觀察。而需要觀察內部超微結構的標本在鋨酸后固定和PBS沖洗后，經2%醋酸鈾染色，乙醇逐級脫水，100%丙酮置換，用環氧樹脂Epon 812包埋，切片機超薄切片，醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色，最后在透射電鏡（TECNAI-10; Philips, Amsterdam, Netherlands）下觀察精子尾部超微結構。

三、遺傳學分析

抽血患者外周血2 m l（E D TA抗凝），應用 QIAamp mini blood kit外周血DNA提取試劑盒（Qiagen，德國）提取基因組DNA。根據SPEF2 基因（Genbank ID：NC_000005）和MNS1（Genbank ID：NC_000015）外顯子及其側翼區堿基序列，采用Premer Premier 6.0 軟件設計相應引物，引物交由上海捷瑞公司合成。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳30min，溴化乙錠染色，于凝膠成像系統中觀察PCR產物特異性。PCR產物純化后再行雙向測序PCR反應，并將產物再次純化后于ABI 3130遺傳分析儀毛細管電泳。應用DNAstar軟件將測序結果與Genebank的參考序列進行對比，確定突變位點。

結 果

一、精液基本參數

經過多次精液檢測3例患者均表現為無活動精子，病例2 在1份精液標本中偶見微動精子。3個病例的精液量和pH值基本正常，精子濃度正常或偏低，精子存活率分別為26%、30%～80%和35.6%。光鏡下形態分析，精子頭部形態無特殊異常，尾部出現嚴重的畸形，突出表現為精子主段增粗、無尾、短尾和卷尾，符合DFS的診斷標準（圖1）。根據DFS缺陷精子的比例，病例1（94.5%）和病例2（99.5%）診斷為完全型DFS，病例3（79.5%）診斷為不完全型DFS。見表1。

二、精子超微結構特點

與光鏡觀察相比，掃描電鏡更加清晰地觀察到精子尾部畸形，部分精子尾部僅存末段樣的結構（圖2A2A）。在透射電鏡下，縱切面可見精子纖維鞘以及線粒體等細胞器未能在正常的位置完成組裝，而是紊亂的堆積在精子尾部（圖2B2B）。橫斷面可見精子纖維鞘明顯增厚，病例1～3精子中心微管缺失率分別為59%, 78%和 62%。內、外側動力蛋白臂不同程度缺失（圖2C2C）。

三、測序結果

3例患者的MNS1和SPEF2基因所有外顯子區均無致病意義突變產生。

圖1 光鏡下DFSDFS精子形態

表1 DFS病例的精液特點

圖2 DFS精子超微結構變化

討 論

鞭毛是精子的運動裝置，嚴重弱精子癥可源于精子鞭毛結構異常[3]。本組病例均表現為100%不動精子，病例2在其中一次檢測中偶見微動精子。光鏡下形態分析，79.5%～99.5%的精子出現粗、短和不規則尾，符合DFS精液特點[5]。根據DFS缺陷精子所占比例，病例1和2為完全型DFS，病例3為不完全型DFS[14]。通過超微結構分析，精子活力的完全喪失更可能與精子動力蛋白臂缺失相關，與受累精子比例無明確關系。本研究中精子存活率為26%～80%不等，即使精子存活率為0%，DFS也并非繼發于死精子癥[14, 15]。

透射電鏡可以對精子尾部超微結構進行觀察，并指導治療方式和病因學研究。當前向運動精子率≤7%且存活率＞50%時，可能存在源于遺傳學因素的精子鞭毛超微結構異常[16]。雖然3個病例在光鏡下表現相近，但超微結構存在差別。中心微管和動力蛋白臂缺失率不同，這提示不同的分子基礎。DFS是精子纖維鞘組裝異常為共同表現的綜合征，是整個精子鞭毛的組裝異常。DFS精子免疫熒光顯示纖維鞘成分散，纖維鞘結紊亂和不完全組裝；多數精子線粒體鞘減少、組裝異常或缺失[17]。

卵胞漿內單精子注射（intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI）使包括DFS在內的多種精子鞭毛異常男性有機會生育后代[18]。但隨之帶來遺傳風險，有必要探尋DFS的分子病因以進行遺傳咨詢。A激酶錨定蛋白3（A-kinase anchoring proteins 3，AKAP3）和AKAP4是精子纖維鞘的主要成分并參與調節精子運動[19]。研究發現5例DFS患者中1例AKAP3、AKAP4基因缺失突變[20]。但是并未發現其余的DFS患者存在AKAP3和AKAP4基因突變[17, 21, 22]。最近，動力蛋白重鏈基因1（dynein heavy chain 1，DNAH1）被確認為部分北非DFS男性的遺傳基礎[23]。我們對6例中國DFS患者的AKAP3和AKAP4全外顯子，以及包含上已報道突變位點的DNAH1基因4個外顯子進行測序，未發現病理性突變[10]。

豬罹患的一種常染色體隱性遺傳病，不活動短尾精子（immotile short tail sperm，ISTS）精子表型類似DFS[24]。這種疾病是由于SPEF2基因插入突變導致[25]。SPEF2基因突變小鼠伴有精子纖維鞘發育異常和嚴重精子尾部畸形[12]。但是本組3例患者SPEF2基因的全外顯子測序，并沒有發現病理性突變。小鼠MNS1對精子鞭毛組裝十分重要，特異性表達于睪丸，肺和卵巢少量表達，編碼軸絲蛋白，蛋白表達于晚期粗線期精子細胞、雙線期生精細胞和精子細胞；突變小鼠表現為不活動短尾精子，軸絲微管和動力臂異常，精子主段缺失[13]。MNS1蛋白存在于人類精子鞭毛[26]，突變小鼠精子表型類似人類DFS，但3例患者MNS1基因測序未能發現陽性結果。從動物模型推測DFS遺傳學病因在本研究中并未奏效，新一代測序技術可能為DFS研究帶來突破。

DFS在中國人群中鮮有報道，作為不動精子癥或嚴重弱精子癥的一種病因，值得臨床關注。對可疑病例通過光鏡下精子形態觀察做出初步診斷，并建議根據超微結構分型。DFS患者的遺傳學病因研究，可能對人類精子形成機制和弱精子癥的病因帶來新的認識。

參 考 文 獻

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（2015-01-08收稿）

**共同通訊作者: 楊慎敏, E-mail: drim2004@126.com, Tel: 13584891093; 馬林偉, E-mail: xht800703@163.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.004

中圖分類號R 698.2

*基金項目資助: 蘇州市科教興衛青年項目（KJXW2013025）; 鹽城市醫學科技發展計劃項目（YK2014058）

A preliminary study on morphology and genetics of dysplasia of the fi brous sheath (3 cases report)*

Wang Jiaxiong1, Yang Shenmin1**, Ma Linwei2**, Cheng Hongbo1, Li Haibo1
1. Center for Reproduction and Genetics, Suzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Suzhou 215002,

Jiangsu, China; 2. Yancheng Institute of Health Sciences
Corresponding author: Yang Shenmin, E-mail: drim2004@126.com, Tel: 13584891093; Ma Linwei, E-mail: xht800703@163.com

AbstractObjective To analyze the sperm morphological characteristics of dysplasia of the fi brous sheath (DFS), and explore the possible genetic origin. Methodsthods Three patients with DFS were identifi ed among severe asthenospermia cases, and their semen samples were collected. Ultra-structural features of semen were studied by scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM). Exons of candidate genes MNS1 and SPEF2 were sequenced to search the mutations. Resultssults Analysis of semen samples from all the three patients showed 100% (or nearly) immotility in sperms, and 26%～80% viability in sperms. The morphological assessment under light and SEM presented severe distorted sperm tails, such as absence, short and thick, coiled, and irregular. The affected spermatozoa were 99.5%, 97.5% and 79.5% respectively. In TEM assays, most spermatozoa showed disorganized fi brous sheath, accompanied by distortion of various cytoskeletal components. The absence of central microtubules (59% to 78%) and dynein arms were observed. No likely pathogenic variants in MNS1 and SPEF2 were identifi ed. Conclusionusion DFS is one cause of severe asthenospermia, and the genetic origin deserves further study.

Key wordsords spermatozoa/ ultrastructure; asthenozoospermia; fl agella