ARMARM結構的缺失對SPAG6SPAG6在哺乳細胞中定位的影響*

汪智瓊張 玲石玉琴李紅飛張志兵, 3**.武漢科技大學醫學院公共衛生學院（武漢 430065） ；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院; 3. Virginia Commonwealth University, Richmond, VA

·論 著·

ARMARM結構的缺失對SPAG6SPAG6在哺乳細胞中定位的影響*

汪智瓊1, 2張 玲1石玉琴1李紅飛1張志兵1, 3**
1.武漢科技大學醫學院公共衛生學院（武漢 430065） ；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院; 3. Virginia Commonwealth University, Richmond, VA

摘要目的 本研究構建精子相關抗原6（SPAG6）基因全長及6個不同長短ARM序列的真核表達載體pEGFPN2-SPAG6-△ARM，并使其在CHO細胞中表達，觀察全長及6個ARM結構缺失后對真核細胞CHO細胞中SPAG6蛋白定位的影響。方法 利用NCBI數據庫，尋找小鼠SPAG6蛋白的保守功能區，分析全長蛋白序列，檢索出SPAG6有7個ARM區域。利用PCR技術擴增出6個缺失不同ARM結構的SPAG6 cDNA，測序后亞克隆至攜帶綠色熒光蛋白基因的pEGFP-N2真核表達載體中，對陽性克隆進行酶切和測序鑒定，將構建的重組質粒轉染到CHO細胞中，分別提取細胞蛋白進行Western blot檢測。利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察7個不同SPAG6/GFP融合蛋白在CHO細胞內的定位。結果酶切和測序鑒定表明，全長及6個缺失不同長短ARM結構的真核表達質粒構建成功，轉染實驗發現重組質粒均能夠在CHO細胞中表達，但僅全長表達產物定位于微管，缺失任何一個ARM區域都可影響在細胞中的微管定位。結論SPAG6在哺乳動物細胞內的正確定位依賴于全長。該研究為進一步研究SPAG6蛋白的結構與功能奠定基礎。

關鍵詞精子相關抗原6基因; ARM結構域; 不育, 男性

Key woorrddss Sperm- associated antigen 6; armadillo domains; infertility, male

男性不育是臨床上常見的一種疾病，隨著社會現代化進程的發展，空氣質量、環境衛生、食品安全及個人婚育觀等問題的不斷凸顯，近年來發病率有急劇上升趨勢。全球目前有10%～15% 的育齡夫婦有生育障礙，其中20%～40%為男性，絕大部分是因為精子功能缺陷而導致不育[1]。精子發生障礙是導致男性不育的一個重要因素，其中遺傳因素缺陷是一個重要機制[2-4]。 正常精子的生成是一個極為復雜的生理過程，許多基因參與這一過程[5]，近年來隨著小鼠基因敲除技術的廣泛運用，越來越多調節精子發生的基因被發現[6]，據報道目前有超過2 300個基因參與[7]。其中精子相關抗原6（Sperm- associated antigen 6，PAG6）是一個重要基因[8]。

SPAG6是最初使用患不育癥的男性患者的高滴度抗體血清篩選睪丸基因表達文庫而克隆出來的[9]。研究發現，SPAG6基因表達蛋白是精子鞭毛支架蛋白的一種，對維持精子鞭毛結構完整和精子鞭毛活動有重要作用。SPAG6基因缺失或沉默時，動物表現為精子活力損傷、精子畸形和雄性不育[10]。經SMART分析軟件得到小鼠SPAG6蛋白由7個armadillo（ARM）區域組成，ARM可介導蛋白-蛋白相互作用從而可能影響蛋白在細胞中的定位及功能。為研究ARM序列對SPAG6定位及蛋白的功能，在構建的含全長SPAG6綠色熒光素報告基因的基礎上，我們構建了6個攜帶不同ARM序列的SPAG6綠色熒光蛋白基因的真核表達載體，并在CHO細胞中表達定位，觀察其與完整PAG6基因表達產物在細胞內定位的差異，探討某一段ARM區域缺失影響了SPAG6在體外細胞中的定位，為進一步探討SPAG6的生物學效應奠定基礎。

材料與方法

一、菌株﹑細胞﹑質粒及主要試劑

小鼠SPAG6/pEGFP-N2 質粒、CHO細胞為本實驗室保存；大桿菌腸DH5a感受態細胞、質粒小提試劑盒及TOP10感受態細胞購自TIANGEN公司；CR試劑盒購自Fermentas公司；限制性核酸內切酶coRI和BamHI購自Thermo公司；ECL試劑盒，TA克隆試劑盒購自Invitrogen公司；BCA蛋白測定試劑盒、T4DNA連接酶購自碧云天公司；DNA marker、rotein marker購自東盛生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM培養液及胰酶購自HYclone公司；FuGene?HD Transfection Reagent購自Roche公司；anti-ɑ-GFP抗體購自博奧森公司；抗actin抗體、抗HRP標記的羊抗鼠IgG購自飛羿科技有限公司；引物合成及DNA序列測定由上海生工生物工程有限公司完成；其他試劑為國產分析純。

二、小鼠SPAG6SPAG6系列缺失ARMARM結構cDNAcDNA的擴增

以小鼠全長SPAG6/pEGFP-N2質粒為模板，用下列引物擴增出系列缺失ARM的SPAG6 cDNA，檢索出SPAG6有7個重復的ARM保守結構區域，進行逐步缺失處理，設計擴增的PCR前后引物，并在引物中加入EcoR I 和BamH I 兩個限制性酶切位點。

共用的上游引物5'-GAATTCAATGAGCCAGCGG CAGGTGCTGCAAG-3'

②缺ARM下游引物5'-GGATCCGAGCAGCCAC GTAACCCAGCATCATG-3'

③缺ARM下游引物5'-GGATCCGTTTTGCAATC TCTCTGATTAAGGTG-3'

④缺ARM下游引物5'-GGATCCGCTTTGCAATC TGACTGAGAGCTGAG-3'

⑤缺ARM下游引物5'-GGATCCGCTTTGAGATA TCACTGAGGGCCGAG-3'

⑥缺ARM下游引物5'-GGATCCGGTGTCTTGCA ATGTATCCGAGTGC-3'

⑦缺ARM下游引物5'-GGATCCGGTAATTGGCC AGTCTCCCCAGAGC-3'

（一）目的基因片段的擴增及回收

PCR擴增，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進行目的片段回收。

（二）TA克隆及鑒定

將回收產物和PCR 2.1載體在T4DNA連接酶作用下進行TA克隆，4℃連接過夜。取2μl TA clone產物轉化至50μl TOP10感受態細胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB培養基上，每板預處理涂有IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷) 40μl（1 mol/L）和X-gal 80μl（20 mg/mL），37℃過夜培養。觀察培養基上有白藍菌落生長，挑取白色單克隆菌落適量擴增后提質粒DNA，經EcoRⅠ和BamH Ⅰ限制性核酸內切酶雙酶切后，電泳觀察酶切結果。

（三）重組質粒測序

將陽性克隆質粒送公司進行測序，獲得6段缺失ARM區域編碼序列。

三、SPAG6/pEGFP-N2FP-N2表達載體的構建

將pEGFP-N2載體和6個系列缺失ARM的SPAG6/ PCR2.1 TA克隆質粒分別用EcoRⅠ和 BamHⅠ雙酶切后，凝膠回收目的片段，將兩個片段用T4DNA連接酶4℃連接過夜，取5μl連接產物轉化到DH-5ɑ大腸桿菌感受態中，37℃培養過夜。挑取單克隆菌落，接種于每毫升培養基含有5μl卡那霉素的LB培養基中，37℃震蕩過夜。用質粒小提試劑盒提取質粒DNA，用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定外源基因的插入，陽性質粒送公司進一步測序分析。

四、SPAG6/pEGFP-N2FP-N2轉染哺乳細胞

CHO細胞用DMEM高糖培養基培養，細胞鋪于六孔板至70%～80%融合，按Roche公司提供的FuGene?HD Transfection Reagent轉染六孔板和chambered slides的說明書進行操作。

五、蛋白質提取與Western Blot Blot鑒定

轉染48h后，棄掉培養基，用PBS清洗兩遍。向6孔板中的每個板中加入200μl含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用無菌槍頭緩慢吹打細胞數次。收集所有液體到新的離心管中，冰上放置30min，裂解細胞。13 000×g，4℃離心10min，將上清轉到新的離心管中，取上清5μl進行定量。

用BCA蛋白測定試劑盒將蛋白定量后，取40μg總蛋白經10% SDS-PAGE凝膠分離，電泳轉膜至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，TBST洗膜15min，3次。用anti-GFP抗體（1:500稀釋），4℃過夜，TBST洗膜3次。再用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠（1:5000稀釋）二抗孵育1h，TBST洗膜15min，3次。ECL顯色，壓片。

六、共聚焦激光掃描顯微鏡觀察SPAG6/GFP6/GFP融合蛋白在細胞內定位

將構建的綠色熒光蛋白表達載體SPAG6/ pEGFP-N2轉染到CHO細胞中48h后，應用OLYMPUS FV 1000S-SIM/IX81激光共聚焦掃描顯微鏡進行掃描，激發光波長為488nm。

結 果

一、小鼠SPAG6SPAG6由7個ARMARM序列組成

為尋找小鼠SPAG6蛋白的保守功能區，用SMART軟件分析全長蛋白序列， 發現SPAG6有7個ARM區域，結果見圖1。

二、6個缺失ARMARM結構的小鼠SPAG6 cDNA cDNA的擴增

為研究ARM區域對SPAG6定位的影響，以全長SPAG6/pEGFP-N2 質粒為模板，6對特異性引物進行聚合酶連反應擴增6個缺失ARM結構基因。擴增的條件為95℃5min預變性；以95℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 90s這3個溫度進行17個循環；最后72℃10min，溫度降至4℃。PCR產物經1%水平瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色后，在凝膠成像儀下照相觀察結果（圖2）。

圖1 蛋白序列示意圖及各段ARM區域對應的氨基酸起點和終點

圖2 PCR CR擴增出的SPAG6SPAG6的全長及6個缺失ARMARM結構的基因序列

三、SPAG6SPAG6全長及缺失不同長短ARMARM區域的SPAG6真核表達質粒的構建和鑒定

將重組質粒SPAG6/pEGFP-N2和pEGFP-N2質粒經EcoRⅠ和BamHⅠ進行限制性核酸內切酶酶切后得到了約4.7kb的pEGFP-N2和不同分子量的7條Spag6條帶，條帶在相應的分子量處（圖3）。

圖3 對重組融合質粒DNADNA，行EcoRⅠEcoR　和BamHⅠBamH　限制性核酸內切酶雙酶切

四、Western blot blot檢測7個不同SPAG6/GFP6/GFP融合蛋白在CHOCHO細胞中的表達

將構建的7個真核表達質粒SPAG6/pEGFP-N2轉染到CHO細胞中，48h以后將提取的蛋白經10%SDSAGE凝膠電泳，Western blot檢測到了融合綠色熒光蛋白GFP的7個SPAG6蛋白表達（圖4）。

圖4 對融合蛋白SPAG6/GFP6/GFP的表達進行Western blot lot 檢測

五、利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察7個不同PAG6/GFP6/GFP融合蛋白在CHOCHO細胞內的定位

將構建的7個帶GFP的真核表達質粒轉染到CHO細胞中，48h以后通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察PAG6/GFP在細胞內定位。觀察7個SPAG6/GFP融合蛋白在細胞內定位，由圖5可看出，僅全長SPAG6在微管中表達，缺失最C端的一個或兩個ARM結構的PAG6，即實驗命名的ARM2和ARM3表達定位于胞漿，當從C端更多的缺失其他ARM結構的SPAG6，即實驗命名的ARM4-7在整個細胞中表達。

討 論

SPAG6是雙鞭毛衣藻PF16（paralysed fl agella 16）的同源體，該同源蛋白衣藻PF16位于鞭毛中央軸突的中心管內參與調節鞭毛的運動[11, 12]。小鼠SPAG6不僅存在于精子鞭毛，在具有運動纖毛的組織，如肺、腦室膜中也有表達，在運動纖毛內，SPAG6定位于調節纖毛運動的中心軸突上，并且決定其他蛋白，如SPAG16L、SPAG17在中心軸突的定位[13, 14]。 SPAG6基因敲除小鼠模型已經建立,SPAG6缺失小鼠由于運動纖毛功能障礙而表現出雄性不育。此外，近一半SPAG6缺失小鼠生長較正常小鼠顯著減慢，提示SPAG6可能和細胞生長有關，最近研究表明SPAG6在肺癌等腫瘤組織中表達顯著增加，表明該基因跟腫瘤形成有關[15]。

過去的研究表明，在體外轉染的哺乳細胞中，SPAG6定位于微管系統[16]，但其微管定位的結構基礎并不清楚。微管是真核細胞普遍存在的一種纖維結構，由微管蛋白和少量微管結合蛋白的聚合作用形成，是細胞骨架的主要成分之一[17]。微管在體內起著十分重要的作用，主要參與細胞運動、細胞器的定位、胞內物質的運輸、真核細胞的有絲分裂過程及細胞信號傳遞等[18-22]。SPAG6定位于微管，該基因可能也參與微管的一些相關作用，為進一步了解其功能，探討其微管定位的結構基礎是非常有必要的。

SPAG6蛋白全長序列中有7個ARM序列。ARM重復序列是介導蛋白和蛋白之間相互作用的一種重要結構域，每個ARM區域都是由42個氨基酸構成，該氨基酸重復序列的特點是高度保守，并且僅有右手超螺旋結構，普遍存在于真核細胞中，相關研究發現ARM區域參與生物的多種重要生理過程，例如參與了細胞信號的轉導、調節胞質內的物質轉換、協助細胞核的物質轉運，還包括調節遺傳物質的轉錄和泛素化過程，即泛素對靶蛋白進行特殊性修飾過程等等[23]。我們設想SPAG6定位于微管依賴于這些ARM序列。為研究這些ARM區域對SPAG6在細胞內定位的影響，在攜帶GFP的表達全長SPAG6真核表達質粒的基礎上，我們又構建了依次缺失ARM序列的6個攜帶綠色熒光蛋白基因的真核表達載體，并在CHO細胞中表達定位，結果發現僅全長SPAG6定位于微管，其他6個缺失ARM的蛋白都不能定位于微管。由于即使缺失最C端ARM的蛋白都不能定位于微管，因此，該ARM序列有可能是介導SPAG6定位于微管的關鍵區域。缺失C端6個ARM的最短的SPAG6/GFP融合蛋白即實驗命名的ARM7，在大部分細胞主要表達在整個細胞中，有些僅在細胞特點部位局部表達，提示最N端的ARM可能有特殊功能。該ARM序列對SPAG6的功能有待于進一步研究。

圖5 SPAG6/GFPP 在CCHHOO細胞內定位

本研究初步探討了SPAG6結構與在細胞內定位的關系，為進一步研究SPAG6的生物學特性及與其他蛋白相互作用奠定了初步基礎。本研究今后將更深入的利用分子生物學的相關技術，在分子水平和細胞水平的基礎上，嘗試從整體水平去分析，利用RNA干擾、基因敲除、酵母雙雜交等手段全面而系統研究該蛋白的更多功能。不僅可進一步的探討SPAG6基因的功能，而且可深入的研究此基因ARM區域的功能，可以為SPAG6基因引起的一類疾病的診斷和治療提供新的思路和方法。

參 考 文 獻

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（2014-03-28收稿）

**通訊作者, Email: zhangzhibing@hotmail.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.001

中圖分類號R 698.2; R 394.33

*基金項目資助: 國家自然科學基金（81172462）、（81300536）、（81302401）及湖北省自然科學基金（2012FFB04904）、（2013CFB331）資助

Effect of ARM domain deletion on SPAG6 subcellular localization in mammalian cells*

Wang Zhiqiong1, 2, Zhang Ling1, Shi Yuqin1, Li Hongfei1, Zhang Zhibing1, 3**
1. School of Public Health,Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430065, Hubei, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecolgy and Biochemistry; 3. Virginia Commonwealth University, Richmond Corresponding author: Zhang Zhibing, Email: zhangzhibing@hotmail.com

AbstractObjective To examine the effect of armadillo (ARM)domains on sperm- associated antigen 6 (SPGA6) localization in CHO cells. Metthhooddss The sequences coding different ARM domains were amplifi ed by polymerase chain reaction (PCR), and were subcloned into the pEGFP-N2 vector. These plasmids were transfected into CHO cells. The expression of the GFP-tagged SPAG6 proteins was proved by Western blot analysis, and localization of GFP-tagged full length and truncated SPAG6 proteins was observed by using laser scanning confocal microscopy. Ressuullttss Truncated SPAG6 proteins with series deletion of ARM domains were successfully constructed into the mammalian expressing vector carrying the green fl uorescent protein gene, pEGFP-N2. The expression of the fusion protein was confi rmed by Western blot analysis. The full length GFP-tagged SPAG6 protein was 1ocalized on the microtubule in the transfected CHO cells, but none of the truncated proteins was localized on the microtybule. Concluussiioonn Microtubule localization of mouse SPAG6 protein is dependent on full length sequence. Construction of the plasmids expressing full length and truncated SPAG6 proteins provides an important tool for further study SPAG6 function.