睪丸腫瘤中β-catenintenin的表達(dá)及其意義*

鄒沙沙 平 萍 宋平平 陳婷婷朱 勇 王柱清 劉 勇 李 錚 胡洪亮上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科（上海 200001）

睪丸腫瘤中β-catenintenin的表達(dá)及其意義*

鄒沙沙 平 萍 宋平平 陳婷婷
朱 勇 王柱清 劉 勇 李 錚 胡洪亮
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科（上海 200001）

摘要目的 初步研究β-catenin蛋白在不同類(lèi)型睪丸腫瘤中的表達(dá)特性，并探討β-catenin分子的表達(dá)與睪丸腫瘤的關(guān)系，為臨床診斷或治療睪丸腫瘤提供一定依據(jù)。方法 隨機(jī)收集我院于2012年1月至2012年12月期間確診的21例睪丸腫瘤組織和1例梗阻性無(wú)精子癥（OA）患者的睪丸活檢組織（作為正常對(duì)照，其睪丸生精功能正常）；同時(shí)，選取5只9周齡的ICR小鼠作為實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充。采用了免疫組化、Western blots 和RT-qPCR等方法來(lái)檢測(cè)β-catenin的表達(dá)情況。結(jié)果 在梗阻性患者中，β-catenin在精原細(xì)胞的胞膜和胞漿中呈現(xiàn)低表達(dá)；在小鼠中，β-catenin也僅表達(dá)在精原細(xì)胞的胞漿和胞膜上。在睪丸腫瘤組織中，睪丸孤立性纖維腫瘤中可檢測(cè)到β-catenin的mRNA和蛋白的高表達(dá)，分別為OA患者的9.4倍和17倍，且其β-catenin主要異位表達(dá)在細(xì)胞核中，可檢測(cè)到磷酸化的β-catenin的表達(dá)。然而，β-catenin在睪丸精原細(xì)胞腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞腫瘤中不表達(dá)或低表達(dá)。結(jié)論 本研究初步表明β-catenin與正常的睪丸生精過(guò)程及病理的睪丸孤立性纖維腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而與睪丸精原細(xì)胞腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞腫瘤之間無(wú)明顯相關(guān)性。但仍需擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行研究，或采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入研究。

關(guān)鍵詞睪丸腫瘤; β連環(huán)素

Key woorrddss Testicular neoplasms; beta-catenin

睪丸腫瘤雖是一種臨床少見(jiàn)的生殖細(xì)胞系腫瘤，但近年來(lái)其全球發(fā)病率呈逐漸增加的趨勢(shì)，是5～45歲青年男性常見(jiàn)的腫瘤之一[1, 2]，睪丸腫瘤約占男性癌癥患者的1%～2%[3]。根據(jù)2004年WHO標(biāo)準(zhǔn)可將睪丸腫瘤分為3類(lèi)，包括生殖細(xì)胞瘤、性索/性腺間質(zhì)腫瘤及其他非特異性間質(zhì)腫瘤[4, 5]。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，環(huán)境及遺傳因素均可致睪丸腫瘤的形成[6-8]。β-catenin已被證實(shí)是Wnt信號(hào)通路中的核心蛋白分子，且大量研究發(fā)現(xiàn)其不僅在胚胎期器官發(fā)育中具有重要的作用；還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。基因突變或外界因素均可導(dǎo)致β-catenin的異常活化，促使腫瘤的發(fā)生[10, 11]。本實(shí)驗(yàn)旨在檢測(cè)不同類(lèi)型睪丸腫瘤中β-catenin的表達(dá)差異，探討β-catenin的異常表達(dá)與睪丸腫瘤之間的關(guān)系。

材料與方法

一、臨床資料

收集我院于2012年1月至2012年12月間的睪丸腫瘤及其癌旁組織標(biāo)本21例，診斷根據(jù)其組織病理學(xué)特征。其中，生殖細(xì)胞瘤15例（病理類(lèi)型均為精原細(xì)胞腫瘤），性索/性腺間質(zhì)腫瘤6例（間質(zhì)細(xì)胞腫瘤4例，睪丸纖維性腫瘤2例）。同時(shí)，獲取1例梗阻性無(wú)精子癥患者（obstructive azoospermia，OA，輸精管梗阻，病理診斷其睪丸生精功能正常）的睪丸活檢組織作為正常對(duì)照。9周齡的ICR小鼠（來(lái)源于上海交通大學(xué)Bio-X中心實(shí)驗(yàn)室）飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，給予其12h（8：00～20：00）光照。

二、免疫組化與免疫熒光檢測(cè)β-catenintenin表達(dá)水平

取出石蠟包埋的組織切片，脫蠟后用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定15min，PBT沖洗min×3次，3%H2O2浸泡30min，PBT沖洗，羊血封閉30min，一抗（兔抗人β-catenin，ABI公司）4℃過(guò)夜孵育，PBT沖洗，二抗（羊抗兔抗體IgG，Vector公司）37℃孵育1h，PBT沖洗，DAB顯色5～15min，BT沖洗，蘇木素復(fù)染30s，乙醇脫水及二甲苯透明處理后用中性樹(shù)膠封片。對(duì)免疫組化結(jié)果采用mage J及SPSS 17.0軟件進(jìn)行圖像處理及統(tǒng)計(jì)分析。

免疫熒光操作過(guò)程與免疫組化過(guò)程相似，其中，熒光二抗避光孵育，細(xì)胞核染色用DAPI顯色。

三、RT-qPCR-qPCR檢測(cè)β-catenintenin分子mRNA表達(dá)水平

用Trizol法提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RTPCR反應(yīng)：使用ABI公司的Taqman?universal PCR master mix試劑和7500儀器進(jìn)行檢測(cè)，熒光染料是SYBR GREENⅠ熒光染料，內(nèi)標(biāo)基因采用β-actin。RT-qPCR的產(chǎn)物可采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。所有引物采用primer 5.0分析軟件設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），由上海生工生物公司合成。

表1 PCR引物序列

四、Western blots lots檢測(cè)β-catenintenin蛋白表達(dá)水平

首先，分別使用promega公司的蛋白裂解液離心收集蛋白。進(jìn)行western blots檢測(cè)β-catenin蛋白的表達(dá)：先配置好10%分離膠和5%濃縮膠，取等量提取的蛋白液加入6×Loading buffer，98℃水浴5min，上樣后電泳（恒壓，90V，30min；120V，60min）。電泳結(jié)束后取出膠，切掉濃縮膠部分，按照吸水墊、3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙、吸水墊的順序夾好轉(zhuǎn)膜夾，4℃進(jìn)行電泳，1.5h（恒流，350mA）。轉(zhuǎn)膜后，配置封閉液，室溫孵育1h。洗膜液清洗，加入Flag一抗稀釋液，置于搖床上，室溫反應(yīng)2h，洗膜液TBST洗3次，每次5min。加入羊抗兔IgG二抗，搖床上室溫下反應(yīng)2h，洗膜液TBST洗3次，每次5min。配置發(fā)光底物，溶液 A和B等體積混合。在暗室中進(jìn)行下列操作：將發(fā)光底物均勻滴在保鮮膜上，PVDF膜正面朝下放于發(fā)光底物上，3 min后包好，放于壓片盒中，上面放一張膠片，反應(yīng)10 min后顯影、定影。蛋白顯影圖片結(jié)果采用Image J及SPSS 17.0軟件進(jìn)行圖像處理及統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié) 果

一、β-catenintenin蛋白在梗阻性無(wú)精子癥患者及睪丸腫瘤患者中的表達(dá)差異

在梗阻性無(wú)精子癥患者睪丸生精小管中，精原細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)見(jiàn)有少量棕黃色顆粒（見(jiàn)圖1A1A，圖1B1B）；同時(shí)，9周齡小鼠的睪丸生精小管免疫熒光結(jié)果顯示，β-catenin蛋白特異性強(qiáng)表達(dá)于小鼠精原細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上（見(jiàn)圖1C1C-圖1E1E）。這也就表明，β-catenin蛋白在正常睪丸發(fā)育過(guò)程中可能特異性表達(dá)于精原細(xì)胞上，并且β-catenin僅表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上，細(xì)胞核中未表達(dá)，說(shuō)明Wnt/ β-catenin通路在成年睪丸精子發(fā)生過(guò)程中尚未被激活，而β-catenin是通過(guò)其他調(diào)控方式參與精原細(xì)胞的增殖分化。

圖1 β-cateninn 在梗阻性無(wú)精子癥患者（免疫組化）及正常小鼠（免疫熒光）睪丸中表達(dá)于精原細(xì)胞胞膜和胞漿中

對(duì)睪丸腫瘤組織及其癌旁組織進(jìn)行β-catenin免疫組化染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，β-catenin在所檢測(cè)的精原細(xì)胞腫瘤與間質(zhì)細(xì)胞腫瘤中沒(méi)有出現(xiàn)高表達(dá)，與梗阻性無(wú)精子癥相比較發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯差異。β-catenin蛋白在睪丸纖維性腫瘤中出現(xiàn)異常高表達(dá)的情況，且主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中；同時(shí)，在其癌旁組織中也呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)（見(jiàn)圖2A2A，圖2L2L）。采用圖像處理軟件分析、定量免疫組化圖片中的陽(yáng)性表達(dá)部位，睪丸纖維性腫瘤組織及其癌旁組織中β-catenin陽(yáng)性部位的面積分別是梗阻性無(wú)精癥的9.4 和7.2倍（見(jiàn)圖3）。

二、睪丸腫瘤中β-catenintenin分子mRNAmRNA與蛋白表達(dá)差異的定量分析

采用Western blot與RT-qPCR方法進(jìn)行半定量分析β-catenin在不同類(lèi)型的睪丸腫瘤中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)β-catenin基因mRNA高表達(dá)于睪丸纖維性腫瘤及其癌旁組織，表達(dá)量分別為梗阻性無(wú)精子癥組織的17倍和5倍（見(jiàn)圖4A4A），結(jié)果與上述免疫組化相一致。Western blot結(jié)果也顯示β-catenin高表達(dá)于睪丸纖維性腫瘤及其癌旁組織，并且可檢測(cè)到β-catenin磷酸化蛋白的表達(dá)（見(jiàn)圖4B4B）。這表明，在睪丸纖維性腫瘤中Wnt通路被激活，即Wnt/β-catenin通路可能參與了睪丸纖維性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。

討 論

在此次實(shí)驗(yàn)研究中，采用了免疫組織化學(xué)方法（圖像分析技術(shù)）和Western blot、RT-PCR等方法來(lái)檢測(cè)分析β-catenin在不同類(lèi)型睪丸腫瘤中的表達(dá)情況。上述結(jié)果表明， 在所收集的睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中，在精原細(xì)胞腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞腫瘤中β-catenin的表達(dá)量均較低。這表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能不參與睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的形成；但在睪丸纖維性腫瘤中檢測(cè)到β-catenin的該信號(hào)通路的異常高表達(dá)，而Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活水平是由細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)水平所決定的，因此，我們推測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了睪丸纖維性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

在睪丸發(fā)育中，李毅等[12]發(fā)現(xiàn)可通過(guò)上調(diào) c-myc基因表的達(dá)來(lái)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)成人睪丸支持細(xì)胞的增殖、分裂。雖然，目前已有一些學(xué)者已指出，β-catenin分子的異常可能會(huì)導(dǎo)致生殖系統(tǒng)的腫瘤形成，卵巢癌的發(fā)生就被證實(shí)與Wnt/ β-catenin信號(hào)通路的失調(diào)有關(guān)[13]，但是，β-catenin與睪丸腫瘤的相關(guān)研究還很少，且國(guó)內(nèi)在這方面的研究幾乎是空白。Chang等[14]發(fā)現(xiàn)在小鼠睪丸發(fā)育中，β-catenin的過(guò)度活化可導(dǎo)致支持細(xì)胞腫瘤的形成；此外，最近的一篇研究也表明在支持細(xì)胞腫瘤患者中可檢測(cè)到β-catenin基因的突變及其在支持細(xì)胞的細(xì)胞核中的異位表達(dá)（即β-catenin的磷酸化）[15]。

圖2 β-cateninn 在睪丸腫瘤組織及其癌旁組織中的表達(dá)

圖3 圖像處理軟件定量分析免疫組化β-catenintenin陽(yáng)性細(xì)胞面積

在本研究中，僅在睪丸纖維性腫瘤檢測(cè)到了β-catenin的異常強(qiáng)表達(dá)，而其在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤上的表達(dá)很弱。與本研究相似的是，已有一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道了β-catenin在纖維性腫瘤中的表達(dá)情況，Rakheja等[16]報(bào)道在孤立性纖維性腫瘤中檢測(cè)到β-catenin的陽(yáng)性率高達(dá)100%；在腸系膜纖維瘤、韌帶樣型纖維瘤病等都可檢測(cè)到β-catenin的異常表達(dá)。由于Wnt信號(hào)通路參與調(diào)控著細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和分化，已被確認(rèn)是與腫瘤相關(guān)的一個(gè)關(guān)鍵性信號(hào)通路。

β-catenin在人類(lèi)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制的相關(guān)研究備受關(guān)注[17]；有研究證實(shí)，通過(guò)抑制β-catenin的表達(dá)可控制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[18]。隨之，藥物研發(fā)者們以該分子作為抗腫瘤治療靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究有效的抗腫瘤藥物治療方案，這些候選抗腫瘤治療方案的主要機(jī)理是從不同水平阻斷β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[19, 20]。因而，深刻理解Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于以β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物的研究具有重要意義。

圖4 RT-qPCRR 和Western blloottss檢測(cè)睪丸腫瘤組織與梗阻性無(wú)精子癥患者睪丸組織中Shh分子的表達(dá)

參 考 文 獻(xiàn)

1 張宏艷, 劉端祺. 睪丸腫瘤流行病學(xué)研究進(jìn)展. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2007; 32(3): 274-275

2 Shanmugalingam T, Soultati A, Chowdhury S, et al. Global incidence and outcome of testicular cancer. Clin Epidemiol 2013; 5: 417-427

3 羅文彬, 姜昊文, 吳忠. 睪丸癌的研究進(jìn)展. 國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志 2007; 27(6): 820-822

4 Huyghe E, Matsuda T, Thonneau P. Increasing incidence of testicular cancer worldwide: a review. J Urol 2003; 170(1): 5-11

5 Bosl GJ, Motzer RJ. Testicular Germ-Cell Cancer. N Engl J Med 1997; 337 (4):242-254

6 Heidenreich A, Knüchel-Clarke R, Pfi ster D. Importance of pathology for therapy planning of testicular germ cell tumors. Pathologe 2014; 35(3): 266-273

7 Goddard NC, McIntyre A, Summersgill B, et al. KIT and RAS signaling pathways in testicular germ cell tumours: new data and a review of the literature. Int J Androl 2007; 30(4): 337-348

8 Bartek J, Bartkova J, Lukas J. DNA damage signaling guards against activated oncogenes and tumour progression. Oncogene 2007; 26(56): 7773-7779

9 Fodde R, Brabletz T. Wnt/beta-catenin signaling in cancer stemness and malignant behavior. Curr Opin Cell Biol 2007; 19(2): 150-158

10 Espada J, Calvo MB, Díaz-Prado S, et al. Wnt signalling and cancer stem cells. Clin Transl Oncol 2009; 11(7): 411-427

11 Rosenbluh J, Wang X, Hahn WC.Genomic insights into WNT/β-catenin signaling. Trends Pharmacol Sci 2014; 35(2): 103-109

12 Honecker F, Kersemaekers AM, Molier M, et al. Involvement of E-cadherin and beta-catenin in germ cell tumours and in normal male fetal germ cell development. J Pathol 2004; 204(2): 167-174

13 Rosanò L, Cianfrocca R, Masi S, et al. Beta-arrestin links endothelin A receptor to beta-catenin signaling to induce ovarian cancer cell invasion andmetastasis. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106(8): 2806-2811

14 Chang H, Guillou F, Taketo MM, et al. Overactive betacatenin signaling causes testicular sertoli cell tumor development in the mouse. Biol Reprod 2009; 81(5): 842-849

15 Perrone F, Bertolotti A, Montemurro G, et al. Frequent mutation and nuclear localization of β-Catenin in sertoli cell tumors of the testis. Am J Surg Pathol 2014; 38(1): 66-71

16 Rakheja D, Molberg KH, Roberts CA, et al. Immunohistochemical expression of beta-catenin in solitary fibrous tumors. Arch Pathol Lab Med 2005; 129(6): 776-779

17 MacDonald BT1, Tamai K, He X. Wnt/beta-cateninsignaling: components, mechanisms, and diseases. Dev Cell 2009; 17(1): 9-26

18 Galuppo R, Maynard E, Shah M, et al. Synergistic inhibition of HCC and liver cancer stem cell proliferation by targeting RAS/RAF/MAPK and WNT/β-catenin pathways. Anticancer Res 2014; 34(4): 1709-1713

19 Moon RT, Kohn AD, De Ferrari GV, et al. WNT and betacatenin signalling: diseases and therapies. Nat Rev Genet 2004; 5(9): 691-701

20 Maruyama K, Ochiai A, Akimoto S, et al. Cytoplasmic beta-catenin accumulation as predictor of hematogenesis metastasis in human colorectal cancer. Oncology 2000; 59(4): 302-309

（2014-08-08收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.002

中圖分類(lèi)號(hào)R 737.21

*基金項(xiàng)目資助: 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30973069）;上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院屬仁濟(jì)醫(yī)院科研種子基金培養(yǎng)計(jì)劃（RJZZ14-017）

Expression analysis of β-catenin in testicular cancer*

Zou Shasha, Ping Ping, Song Pingping, Chen Tingting,
Zhu Yong, Wang Zhuqing, Liu Yong, Li Zheng, Hu Hongliang Department of Urology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University Shanghai 200001, China

AbstractObjective To study and analyzes the expression pattern and association of β-catenin in testicular cancer, and explore the role of Wnt/β-catenin signaling pathway in the mechanism of testicular cancer occurrence， thus provide evidence for clinical diagnosis and therapy of testicular cancer. Metthhooddss We randomly collected 21 cases of testicular cancer biopsy tissue and the testicular biopsy tissue of one obstructive azoospermia patient (OA, as healthy control, due to the completely normal spermatogenic function) in Hospital, from 2012.01 to 2012.12. Five 9w ICR mices were also used in the additional experiments. Expression of β-catenin in the process of spermatogenesis and testicular cancer was detected and quantifi ed by using immunohistochemical, Western blot and RT-qPCR. Ressuullttss In the obstructive azoospermia patient, β-catenin is weakly expressed in the cell membrane and cytoplasm of spermatogonia. Moreover, in the testis of 9w ICR mices, β-catenin is expressed in the cytoplasm and cell membrane of spermatogonia. However, the results of testicular cancer showed obviously high protein and mRNA expression levels of β-catenin in testicular solitary fi brous tissue, 9.4 folds and 17 folds, respectively, but not in other testicular tumours. β-catenin is ectopicly expressed in the cellular nucleus of testicular solitary fi brous tissue, and we also detected the phosphorylation β-catenin by western blot. Concluussiioonn The results suggested β-catenin may be associated with the process of spermatogenesis and testicular tumor, but not other testicular tumours. However, Considering the limit of sample size, future validating studies in more samples and mechanism study in animal experiments are strongly suggested.