SOE—PCR在稻瘟病菌基因敲除中的應(yīng)用

摘要：稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度減產(chǎn)。稻瘟病菌具有許多植物病原真菌侵染循環(huán)的重要特點(diǎn)，其侵染過程、致病機(jī)理和其中伴隨的基因行為在致病真菌中具有典型性。本文綜述了SOE-PCR技術(shù)的原理及其在稻瘟病菌基因敲除方面的應(yīng)用情況，并指出此技術(shù)中要注意的問題，展望了其在稻瘟病研究中的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：重疊延伸PCR，稻瘟病菌，基因敲除技術(shù)

1.SOE-PCR技術(shù)的原理

重疊延伸PCR技術(shù)（gene splicing by overlap extension PCR，簡(jiǎn)稱SOE PCR）[1，2]，是一種采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，在接下來的反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將來源不同的擴(kuò)增片段重疊連接起來且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理的技術(shù)，該技術(shù)在敲除基因片段上具有很大的優(yōu)勢(shì)。

2.SOE-PCR技術(shù)在稻瘟病菌研究中的應(yīng)用

從稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫中選取想要敲除掉的致病基因，并獲得該基因的上、下游基因序列。以一段帶有潮霉素標(biāo)記的基因序列來代替欲敲除基因。SOE-PCR 是將不同來源的兩個(gè)基因或DNA 片段拼接起來構(gòu)成融合基因的方法。兩段基因的引物其中有兩條是常規(guī)的引物，兩外兩條引物是特殊設(shè)計(jì)的，其序列上一端與自身的目的片段互補(bǔ)，另外一端卻是另外一段目的基因的序列。這樣經(jīng)過各自的PCR克隆后，在各自的產(chǎn)物其中的一端加上特別的接頭。然后把PCR 產(chǎn)物處理后，利用接頭的特異互補(bǔ)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，從而將兩段PCR 產(chǎn)物連接到了一起，形成了不靠限制性內(nèi)切酶連接的雜交基因片段。在重疊延伸PCR中，兩個(gè)重疊的DNA片段是分別從兩個(gè)獨(dú)立的PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到的，預(yù)設(shè)突變構(gòu)建在重疊區(qū)域中。整個(gè)過程需要4對(duì)引物，用引物AF和AR，通過PCR的方法從稻瘟病菌基因組DNA擴(kuò)增待敲除基因的上游A片段，接著用引物BF和BR再從稻瘟病菌基因組DNA中擴(kuò)增待敲除基因的下游B片段，再用引物HYG/F和HY/R擴(kuò)增出潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶序列內(nèi)部的正向引物HPH1，用引物YG/F和HYG/R擴(kuò)增出潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶序列內(nèi)部的反向引物Hph2。再通過SOE-PCR的方法搭橋連接待敲除基因的上游A片段和Hph1、待敲除基因的下游B片段和Hph2，獲得該基因的AH和HB片段。取上述PCR產(chǎn)物AH、HB片段各5μg，利用PEG介導(dǎo)的方法導(dǎo)入稻瘟菌的原生質(zhì)體中。原生質(zhì)體復(fù)蘇后，在含有300 μgmL-1潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)。5～7天后，在平板上挑取具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。將所挑取的轉(zhuǎn)化子在固體酵母培養(yǎng)基中培養(yǎng)含3～5 天，收集菌絲，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證是否為敲除突變體。

3.SOE-PCR的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)

3.1優(yōu)點(diǎn)：①操作步驟簡(jiǎn)潔，耗時(shí)短，可行性高；②不需要設(shè)計(jì)特定的酶切識(shí)別位點(diǎn)，將DNA片段拼接到一起；③可以進(jìn)行高保真的定點(diǎn)、定位突變；④可以利用PCR將不同來源的DNA片段連接起來。一些基因來源的材料比較難得，很難將這些基因模板提取出來，并且提取出來的模板特異性不強(qiáng)。此時(shí)，利用重疊延伸PCR 技術(shù)，可以不需要從原始材料中獲取目的基因，而是從其他含有目的片段模板中擴(kuò)增，并實(shí)現(xiàn)突變、連接等。

3.2缺點(diǎn)：①容易產(chǎn)生隨機(jī)突變，需要優(yōu)化PCR過程；②對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求很高。

4.展望

利用抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一，然而，水稻品種在生產(chǎn)上大面積推廣3～5年后，抗性下降或喪失。研究者們利用對(duì)基因的加工和修飾來達(dá)到自己的研究目的，而前提是要獲得目的基因。在實(shí)際操作中，某些目的基因的獲得存在一定的困難，然而SOE-PCR技術(shù)不需要通過內(nèi)切酶消化和連接酶處理即可獲得，對(duì)于一些基因來源材料比較難得的基因，很難將這些基因模板提取出來，并且提取出來的模板特異性不強(qiáng)。可以不需要從原始材料中獲取目的基因，而是從其他含有目的片段模板中擴(kuò)增。使研究人員在基因操作上節(jié)省了大量時(shí)間。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡(jiǎn)介：衣雨嬌（1993～ ），女，漢，福建農(nóng)林大學(xué)，植物保護(hù)學(xué)院大三學(xué)生。

（福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州 350000）