基于psbA—trnH序列的劍麻H.11648原始母本的鑒定

金剛　陳濤　蘇文潘　黃強　覃旭　呂平　覃劍峰　王春田

摘要：劍麻H.11648（Agave hybrid No.11648）是以藍劍麻（A. amaniensis）和假菠蘿麻（A. angustifolia）為親本進行雜交，F1再與藍劍麻回交選育而來。分析了劍麻H.11648及其兩個親本葉綠體psbA-trnH序列的差異。結果表明，劍麻H.11648與藍劍麻的psbA-trnH存在1個明顯的SNP差異，而在該位點與假菠蘿麻保持一致，從葉綠體DNA水平證實了劍麻H.11648的細胞質來源于假菠蘿麻。

關鍵詞：劍麻H.11648（Agave hybrid No.11648）；藍劍麻（A. amaniensis）；假菠蘿麻（A. angustifolia）；psbA-trnH

中圖分類號：S563 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2513-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.057

劍麻（Agave sisalana Perr. ex Engelm.）是龍舌蘭科（Agavaceae）所屬單子葉植物的統稱，也稱為龍舌蘭麻。該科有9屬293種，大多原產于墨西哥一帶，龍舌蘭屬是該科中最重要的一個屬[1]。劍麻纖維具有色澤潔白、質地堅韌、富有彈性、拉力強、耐磨擦、耐酸堿、耐腐蝕、不易打滑等特點，已成為目前用量最大、范圍最廣的一種硬質纖維。由于劍麻的原產地不在中國，我國的劍麻種質資源比較匱乏，育種工作相對滯后，劍麻栽培品種單一化的問題相當嚴重[2]。目前，我國劍麻種植區的當家品種為H.11648，其種植面積占98%以上，其他栽培品種廣西76416和番麻主要用于補植。劍麻H.11648是由東非坦桑尼亞劍麻試驗站育成，該品種是以假菠蘿麻（A. angustifolia）為母本、藍劍麻（A. amaniensis）為父本進行雜交，獲得有性雜種第一代（F1），再利用開花的F1作為親本與藍劍麻回交而獲得有性雜種回交一代（BC1），通過系比、選擇而育成[3-5]。但有些研究資料記載劍麻H.11648的雜交選育過程為（藍劍麻×假菠蘿麻）×藍劍麻[6]。這一問題可以歸結為劍麻H.11648的細胞質究竟來源于藍劍麻還是假菠蘿麻。

運用物種特異的DNA序列信息位點，能夠給劍麻H.11648的細胞質來源提供可靠的科學依據。psbA-trnH片段是位于葉綠體基因組上psbA基因和trnH基因之間的一段非編碼序列，長約300 bp，可用于植物屬間及種間的系統發育研究。本研究基于劍麻葉綠體基因組的遺傳信息，分析了劍麻H.11648、藍劍麻和假菠蘿麻psbA-trnH序列的差異，以期揭示劍麻H.11648的細胞質來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 劍麻H.11648及其原始親本假菠蘿麻和藍劍麻的新鮮幼嫩葉片均取自廣西亞熱帶作物研究所龍舌蘭麻種質資源圃。

1.1.2 生化試劑 Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和dNTPs購自北京康為世紀生物科技有限公司；pUCm-T載體、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和大腸桿菌DH5α感受態細胞購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物由華大基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1 葉綠體psbA-trnH序列PCR擴增 采用改進的CTAB法提取劍麻總DNA[7]。psbA-trnH序列擴增的參考通用引物，trnH2R（GUG）：5′-GCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′；psbA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′[8]。PCR反應采用20 μL擴增體系，包括DNA模板1.0 μL、10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 2.0 μL、Primer F（2.5 μmol/L） 1.0 μL、Primer R（2.5 μmol/L） 1.0 μL、Pfu DNA聚合酶0.2 μL、超純水12.8 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。

1.2.2 psbA-trnH序列測定 利用Pfu酶擴增3份材料的葉綠體psbA-trnH序列后，再向反應液里加入5 U的Taq DNA酶，混勻后置于72 ℃反應30 min，進行簡易的加A反應。反應結束后，用1.1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。回收純化目的片段后，連接至T載體后進行DH5α大腸桿菌感受態的轉化并進行藍白斑篩選，挑取白色陽性克隆交由華大基因公司測序。

1.2.3 多重比對 應用DNAman 6.0.3.99軟件對劍麻H.11648、藍劍麻和假菠蘿麻的psbA-trnH序列進行多序列同源性分析，參數取原始默認值。

2 結果與分析

2.1 psbA-trnH序列的PCR擴增

利用psbA-trnH序列的通用引物，以劍麻H.11648、藍劍麻和假菠蘿麻的葉片總DNA為模板，進行PCR擴增，結果見圖1。從圖1中可以看出，從劍麻H.11648、藍劍麻和假菠蘿麻中均擴增出約700 bp的單一條帶。

2.2 劍麻H.11648與其親本psbA-trnH序列比較

多重比對結果表明，3份種質psbA-trnH序列的相似度很高，僅存在2個SNP位點。其中一個為藍劍麻與另外2份種質的C/T差異。第二個SNP位點在假菠蘿麻中出現，表現為1個胸腺嘧啶的缺失。由于該處出現連續的胸腺嘧啶，有可能是由于Pfu DNA聚合酶的不穩定擴增導致（圖2）。因此，未將第二個SNP位點作為判斷劍麻H.11648原始母本來源的判斷依據。由于被子植物細胞質基因組母系遺傳的特征，結合劍麻H.11648的系譜關系，從第一個SNP位點即可判斷其原始母本為假菠蘿麻。

3 小結與討論

植物細胞質基因分布在葉綠體、線粒體等細胞器中，與核基因一樣，具備完備的復制與表達功能，但其遺傳方式卻不遵守孟德爾遺傳定律。葉綠體在裸子植物中一般為父系遺傳，而在被子植物中多為母系遺傳[8，9]。本研究利用Pfu高保真酶的擴增進而通過測序獲得的psbA-trnH序列信息。按照母系遺傳的學術觀點，后代與母本的質體遺傳信息具有一致性。本研究結果表明，藍劍麻與另外2份種質存在一個C/T的SNP位點差異，而假菠蘿麻和劍麻H.11648在同一位點保持一致，即確定了劍麻H.11648的細胞質來源于假菠蘿麻。藍劍麻、假菠蘿麻和劍麻H.11648的psbA-trnH序列差異從葉綠體基因水平上為劍麻H.11648的細胞質來源提供了可靠的參考依據。結合前人的資料記載，本研究確定了劍麻H.11648是通過（假菠蘿麻×藍劍麻）×藍劍麻的雜交方式選育而成，而并非（藍劍麻×假菠蘿麻）×藍劍麻。本研究為劍麻細胞質育種的母本選擇提供了參考依據，也為psbA-trnH序列應用于龍舌蘭屬植物的系統分類奠定了基礎。

參考文獻：

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