魔芋芋花葉病毒的檢測

盛佳婧 鐘琳 楊朝柱 胡凱 王大平 吳金平 胡中立 刁英

摘要： 為評價魔芋（Amorphophallus konjac）體內芋花葉病毒檢測方法，利用人工接種芋花葉病毒的魔芋作為試驗材料，分別采用DAS-ELISA、RT-PCR、熒光定量PCR等3種方法進行檢測。結果表明，對于人工接種芋花葉病毒1周，植株出現有明顯病征的魔芋，熒光定量PCR檢測的靈敏度最高、RT-PCR次之，而DAS-ELISA酶聯檢測法靈敏度較低。

關鍵詞：魔芋（Amorphophallus konjac）；芋花葉病毒；DAS-ELISA；RT-PCR；熒光定量PCR

中圖分類號：S436.32 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2519-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.059

魔芋（Amorphophallus konjac）是天南星科魔芋屬多年生草本植物，已有2 000多年的種植歷史[1]。魔芋是世界上迄今為止發現的惟一含有大量葡甘聚糖的植物。近年來隨著葡甘聚糖營養保健功能的逐步被發現和在食品工業上的廣泛應用，魔芋產品的市場需求逐年擴大，但因常年無性繁殖，使病毒積累、種性退化，其豐產性和品質無法保證[2]。芋花葉病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）是天南星科植物上發生最普遍和危害最嚴重的病毒[3]。

目前植物病毒的檢測方法主要包括生長季隔離檢疫、指示植物接種、血清學檢測、免疫電鏡和分子生物學檢測[4，5]。已報道用ELISA和RT-PCR法來檢測魔芋中芋花葉病毒[6]。熒光定量PCR是在常規PCR基礎上將熒光共振能量轉移與熒光標記探針結合，將核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術融合在一起的一項創造性技術，它具有快速、靈敏、高通量、特異性強、自動化程度高、重復性好、準確定量等特點[7]。實時熒光定量PCR技術被廣泛應用于醫學診斷、海關檢驗檢疫、國防軍事、新型農業、基礎研究等領域[8，9]，尤其在動物醫學病理和分子生物學研究領域應用十分廣泛[10]。

本研究在前人研究的基礎上，結合植物病毒檢測的特點，采用DAS-ELISA、RT-PCR和熒光定量PCR對魔芋中的芋花葉病毒進行檢測，為魔芋病毒的快速診斷提供了技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

芋花葉病毒由華中農業大學洪霓教授提供，接種材料為組培得到的清江花魔芋（A. konjac cv. qingjiang）脫毒植株。

1.2 試劑

植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；5×M-MuLV反轉錄酶緩沖溶液、M-MuLV 反轉錄酶購自Promega公司；dNTPs、10×Taq Reaction Buffer、Taq DNA Polymerase、DL2000 Marker購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；DSMV ELISA 試劑盒購自美國Rapidbio公司；2×SYBR Master Mix購自TOYOBO公司。引物由上海英駿生物技術有限公司合成，序列測定由上海桑尼生物科技股份有限公司完成。

1.3 病毒的接種

將帶病毒的新鮮魔芋葉片用液氮研磨至粉末后溶解于接種緩沖液（5 mL PBST，0.1 g PVP-40，

0.005 g BSA，0.022 5 g 銅試劑）中，并用紗布過濾到1.5 mL EP管中，插入冰水中備用。接種前洗凈手指，用干凈的鋼絲球沾取帶病汁液在健康魔芋葉片上摩擦，接種后用無菌水沖洗葉面，去除緩沖液對葉片代謝的影響。接種1周后魔芋葉片出現白色斑點，葉片邊緣出現輕微卷邊的癥狀（圖1），說明芋花葉病毒已經成功接種到健康魔芋植株上。

1.4 病毒的檢測

1.4.1 DAS-ELISA檢測 稱取0.3 g的帶病葉片，加入到3 mL PBS（pH 7.4）溶液中，用勻漿器將標本充分勻漿，離心20 min收集上清。按照ELISA試劑盒的步驟進行操作，測定405 nm 波長下的OD值。數據判斷標準：陽性對照孔平均值≥1.00，陰性對照平均值≤0.10，臨界值計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。陰性判定標準：樣品OD405 nm<臨界值者為陰性；陽性判定標準：樣品OD405 nm≥臨界值者為陽性。

1.4.2 RT-PCR 檢測 參考文獻[6]合成檢測引物（5′-GGGCTTGGGTGATGATGGA-3′，5′-GCCTTTCAGTGTTCTCGCTTG-3′），擴增的目的片段長度為310 bp。采用植物總RNA提取試劑盒提取魔芋葉片總RNA，具體方法依照說明書進行。PCR體系采用25 μL反應體系進行，包括cDNA 1.5 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），dNTPs 0.5 μL（10 mmol/L），10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 2 μL（25 mmol/L），Taq DNA酶1 U，ddH2O 15.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，36個循環；再72 ℃延伸5 min。PCR產物以1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，并將PCR產物送至上海桑尼生物科技股份有限公司進行序列測定。

1.4.3 熒光定量PCR檢測 以cDNA（稀釋100倍）為模板進行熒光定量PCR檢測。熒光定量PCR反應體系為20 μL，包括cDNA模板2 μL、2×SYBR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL（20 μmol/ L）。PCR 反應程序：95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個循環。每個樣品設定3個平行，反應在ABI實時熒光PCR 儀上進行。

2 結果與分析

2.1 DAS-ELISA檢測結果

DAS-ELISA檢測結果如圖2所示。由圖2可以看出，陽性對照1和7的OD405 nm分別為2.987 1、3.172 3；陰性對照2和8的OD405 nm分別為0.080 2、0.073 5；空白對照6的OD405 nm是0.070 2；平行樣品3、4、5的OD405 nm分別為0.981 7、0.706 7、0.123 4；平行樣品9、10、11、12的OD405 nm分別為1.020 6、0.119 3、0.103 6、0.105 2。雖然接種芋花葉病毒的魔芋葉片有稍許顏色反應，但達不到檢測試劑盒要求的陽性標準，DAS-ELISA檢測的靈敏度較低。

2.2 RT-PCR檢測結果

接種芋花葉病毒的魔芋能擴增到預期大小的條帶（圖3），而健康魔芋樣本無此片段出現。BLAST比對結果表明，本研究中擴增的序列與DsMV其他株系的對應序列覆蓋率可達到100%，相似性最高達到99%，說明所得DNA片段確為DsMV的基因片段。

2.3 熒光定量PCR檢測結果

熒光定量PCR檢測了稀釋100倍的病毒樣品，檢測到熒光信號，25個循環數左右達到平臺期，條帶特異性較強，能確定是目的序列擴增（圖4）。結果表明，熒光定量PCR能夠檢測魔芋花葉病毒。

3 小結與討論

基于免疫學原理的ELISA相關方法對設備要求低、操作簡單、成本偏低，可用于基層大量樣品的檢測等優點，廣泛用于病毒的檢測，但往往非特異性反應（即假陽性）的問題較普遍，對于某些材料的檢測靈敏度也不夠高。本研究中接種病毒的植株已經明顯出現的病癥，但采用ELISA方法進行檢測，卻并未得到可靠的陽性結果。基于分子生物學技術的RT-PCR方法在反應特異性和靈敏度方面大大提高，而且沒有免疫學方法中制備抗血清的限制，檢測的時間較短，但對于帶毒量偏低的材料仍有其局限性。熒光定量PCR技術是最近幾年發展最快的技術之一，是由熒光技術和普通PCR擴增系統相結合，克服了普通PCR技術的不足，且簡化了檢測過程，特異性和靈敏度都較高，可以用于帶毒量偏低的帶病植株的分子檢測。本研究中熒光定量PCR的模板濃度比RT-PCR低100倍，仍然能夠檢測出陽性結果，表明熒光定量PCR的靈敏度確實優于RT-PCR。但是熒光定量PCR檢測對儀器要求較高，需要專門的熒光定量PCR儀，而RT-PCR在普通的PCR儀上就能進行，一般實驗室即可以開展檢測工作。

參考文獻：

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