液基薄層制片技術制作外周血淋巴細胞涂片方法學的建立及免疫組化染色應用

孔慶暖 王麗娜

[摘要] 目的 應用液基薄層制片技術制作外周血淋巴細胞涂片，以期建立更加簡單直觀且能夠與分子生物學相結合的外周血淋巴細胞形態學檢查方法。 方法 利用Ficoll-hypaque密度梯度離心法分離外周血淋巴細胞，液基細胞保存液中過夜保存，液基薄層涂片技術制作細胞涂片，并通過SP免疫組化染色觀察T淋巴細胞及B淋巴細胞表面抗原CD3和CD20在涂片淋巴細胞中的表達，并通過表達部位獲取兩種抗原的免疫表型保存情況。 結果 對5名健康者外周靜脈血制作淋巴細胞涂片，淋巴細胞獲得率達95%以上，形態保存完好，SP免疫組化法顯示，CD3和CD20抗原均清晰表達在相應淋巴細胞亞群的細胞膜上，通過免疫組化法計數的淋巴細胞亞群比例和文獻結果相一致。 結論 與傳統外周血手工涂片相比，液基薄層制片技術制作外周血淋巴細胞涂片可快速有效地應用于外周血淋巴細胞形態學觀察和免疫組化染色，對臨床淋巴細胞亞群分類、淋巴瘤分型及預后判斷有重要的應用價值。

[關鍵詞] 外周血；淋巴細胞；液基薄層制片；免疫組化

[中圖分類號] R446.111 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（c）-0023-04

Establishment of preparing lymphocytes smears with thinprep liquid-based technology in blood and application of immunostaining

KONG Qingnuan1 WANG Li'na2 HAN Zenglei1 HUANG Weiqing1▲

1.Department of Pathology， Qingdao Municipal Hospital， Shandong Province， Qingdao 266071， China； 2.Department of Clinical Laboratory， the Sixth People's Hospital of Qingdao City Qingdao City Hospital for Infectious Diseases， Shandong Province， Qingdao 266000， China

[Abstract] Objective To develop a new morphological examination method which make smears of lymphocytes in peripheral blood as well as applied with immunohistochemistry using thinprep liquid-based technology. Methods After separated by Ficoll-hypaque density centrifugation， lymphocytes in peripheral blood were preserved in special PreservCyt Solution overnight. And liquid-based smears were prepared with cytospin on the principle of thinprep cytologic test. The immune phenotype of lymphocytes were observed with CD3 and CD20 immunohistochemistry staning. Accurate expression location indicated the condition of antigen preservation in lymphocytes. Results The lymphocytes yields of five healthy volunteers reached up to 95% with complete and clear cell morphology. CD3 and CD20 were accordingly expressed on cell membranes of two lymphocyte subsets. The proportion of the two lymphocyte subsets calculated by immunohistochemstry staining was in accordance with previous literature. Conclusion The application of preparing lymphocytes smears with thinprep liquid-based technology in blood method in lymphocytes morphology observation and immunohistochemistry staining is rapid and effective compared with conditional manual blood smears. The method also has important values on lymphocyte subsets classification， lymphoma classification and prognosis.

[Key words] Peripheral blood； Lymphocytes； Thinprep liquid-based technology； Immunohistochemistry

目前外周血形態學檢測主要是應用傳統血涂片的方法，但是存在重復性差、涂片質量較低等缺點，且對淋巴系統相關病變引起的外周血淋巴細胞形態學改變不能細致觀察，漏診率高，無法應用于下一步的分子生物學檢測[1]。液基細胞學，簡稱TCT（ThinPrep Cytology Test），是一種將脫落細胞保存在液體中，并通過特殊設備將細胞均勻分散貼附在載玻片上制成涂片的技術，20世紀90年代中后期開發[2]，目前主要在病理科應用于宮頸細胞學及體腔脫落細胞學檢測，它是通過機械、氣動與流體力學原理，用全自動設備將細胞涂成均勻的薄層標本，其操作方法簡單，細胞形態和細胞表面相關抗原保存良好，技術水平先進[3-4]。因此，本研究通過反復實驗和條件調整，將液基薄層制片技術與外周血淋巴細胞提取相結合，跨學科建立了一種可清晰準確地觀察外周血淋巴細胞形態的方法，經過驗證該方法可應用于進一步SP免疫組化染色，該方法的建立將為惡性淋巴瘤的臨床診療及判斷預后帶來新的思路，有非常廣闊的應用前景。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇健康自愿捐獻外周血者5名，均無淋巴造血系統疾病等慢性病史、惡性腫瘤病史、近期急性感染病史，1個月內未服用任何藥物；男2名，女3名，年齡25～43歲，平均32.6歲；每人抽取外周靜脈血3 mL，常規EDTA抗凝管抗凝。

1.2 主要試劑和儀器

淋巴細胞分離液（北京Solarbio）；液基細胞處理試劑盒（寧波美生醫療器材有限公司）；兔抗人CD3單克隆抗體（1∶200，福建邁新生物技術有限公司）；兔抗人CD20單克隆抗體（1∶300，福建邁新生物技術有限公司）；自動細胞制片機（寧波美生醫療器材有限公司）；低溫冰箱（青島海爾）；可控式恒溫干燥箱（山東濰坊精鷹醫療器械有限公司）。

1.3 外周血淋巴細胞提取

應用Ficoll-hypaque密度梯度離心法（1800 r/min）分離淋巴細胞，具體步驟如下：吸取新鮮EDTA抗凝血（30 min內）2 mL，室溫下13 000 r/min離心3 min，去除上層血漿后加入4 mL淋巴細胞分離液，低溫離心機離心30 min（4℃，1800 r/min），小心緩慢吸取第2層白色絮狀物（淋巴細胞層），用Hanks液低速離心洗滌細胞3次，將沉淀細胞保存于液基細胞處理試劑盒（內含細胞保存液3 mL）內，輕微震蕩后室溫過夜。

1.4 淋巴細胞液基涂片制備

取2 mL室溫過夜后的上述細胞保存液，常溫下用自動細胞制片機離心5 min（1800 r/min），淋巴細胞離心于自動細胞制片機內的黏附載玻片上，制備成直徑2 cm的薄層液基細胞涂片，室溫5 min晾干，在預冷的4℃純丙酮中固定20 min后進行Giemas染色評估淋巴細胞形態及淋巴細胞百分比。

1.5 免疫組化染色

上述純丙酮固定的淋巴細胞涂片經PBS沖洗（3次，5 min/次）后，采用檸檬酸鹽（1∶100，pH 6.0）微波修復，將檸檬酸溶液放于微波爐中加熱至沸騰后放入涂片，持續2.5 min，自然冷卻后加入3%過氧化氫孵育30 min，PBS沖洗（3次，5 min/次），滴加50 μL一抗4℃過夜（兔抗人CD3、CD20單克隆抗體），PBS沖洗（3次，5 min/次），二抗（通用型IgG抗體）37℃孵育10 min，PBS沖洗后（3次，5 min/次）DAB顯色3 min，蘇木精復染30 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。

2 結果

2.1 淋巴細胞形態及比例評價

傳統外周血涂片是應用推片技術制作，優點在于能夠觀察全血細胞的形態學改變，但由于受到手工操作限制，存在方法操作一致性差、細胞涂片過厚、由于紅細胞過多對淋巴細胞形態觀察不仔細等缺點，而且涂片觀察有時間性的限制。應用液基細胞技術制備的淋巴細胞涂片，殘余紅細胞可被細胞保存液有效破壞，且細胞經過固定，采用中性樹膠封片，保存時間長久。Giemas染色證實，該方法制備淋巴細胞涂片細胞操作簡單，一致性好，形態完整，細胞核清晰，核膜圓滑，無細胞自溶脹大，無皺縮脫水等現象，5張涂片淋巴細胞比例均96%以上。見圖1（封四）。

2.2 免疫組化染色評估

免疫組化抗體CD3抗原標記T淋巴細胞亞群，CD20抗原標記B淋巴細胞亞群，兩者陽性標記均為細胞膜棕黃色顆粒沉積。染色完成后每張涂片計數100個細胞，統計陽性染色T淋巴細胞及B淋巴細胞比例。SP免疫組化染色結果顯示，CD3及CD20抗體均在淋巴細胞細胞膜完整清晰表達（圖2、3，封四），統計結果顯示，5名健康者外周血中T淋巴細胞所占比例平均80.6%，B淋巴細胞所占比例平均6.6%，見表1。T淋巴細胞及B淋巴細胞比例與流式細胞學等檢測方法結果基本一致[5-8]。

3 討論

外周血檢測創傷性小，簡單快速，標本易于獲得，可檢測指標廣泛，是臨床輔助檢查的重要工具[9]。隨著惡性淋巴瘤發病率的逐年上升，外周血對于早期發現異形淋巴細胞、淋巴瘤患者的臨床特征，評估治療效果及淋巴瘤預后監測等有重要的價值[10-11]。王冰潔等[12]研究表明，不同淋巴瘤類型呈現不同的EBV感染狀態，外周血EBV-DNA陽性為影響淋巴瘤患者總生存率的獨立預后因素。然而由于流式細胞學和其他分子生物學等新技術的飛速發展，以外周血涂片為主的傳統血液形態學因為涂片質量等原因受到極大的發展限制[13-14]。液基薄層制片技術是近幾年迅速發展的細胞學檢測方法，目前主要應用于婦科及胸腹腔脫落細胞學檢查，在病理科應用較為廣泛[4，15-16]。近年來免疫組化在液基細胞學中的應用價值已得到廣泛證實：P16和Ki67免疫組化聯合應用能顯著提高宮頸上皮內瘤變的液基細胞陽性率；在胸腹水脫落細胞學中，免疫組化能夠清晰地標記出惡性腫瘤細胞并進行腫瘤分型[17-19]。本研究將該技術應用到血液學檢查中，發現通過這種方法保存和制作的淋巴細胞涂片，操作簡單，制作的細胞形態完整清晰，且能夠應用于進一步的免疫組化檢查。

眾所周知，固定液的成分對細胞抗原保存非常重要，固定液的不正確應用可導致細胞膜上的抗原丟失，對后續免疫組化產生假陰性結果。在實驗過程中，筆者對比了純酒精、10%中性甲醛、常溫丙酮及4℃純丙酮4種不同的固定液成分，通過反復條件調整和摸索，確認4℃純丙酮是最佳固定試劑，將丙酮提前24 h放入4℃冰箱預冷，該方法不僅可以為后續免疫組化保存了完整的抗原，且細胞黏附力好，在反復沖洗過程中不易脫片，該方法也是借鑒了婦科脫落細胞免疫組化的固定條件[20-21]。本研究所用的液基細胞保存液是成熟的商業化產品，所含成分能夠有效地破壞殘余紅細胞，完全去除紅細胞對涂片質量的影響，因此淋巴細胞得率高，基本保存了外周血中所有淋巴細胞類型，能夠反映外周血淋巴細胞的基本情況。CD3和CD20是淋巴細胞的重要標志物，分別表達在T淋巴細胞及B淋巴細胞細胞膜上。現有研究表明，血液中淋巴細胞分類以T淋巴細胞為主，比例占80%左右，B淋巴細胞比例為3%～10%不等，筆者通過免疫組化證實，該方法所獲得淋巴細胞比例與之前的研究結果基本一致[5-8]，因此該方法對淋巴細胞亞群分型有重要的應用價值。

目前廣泛應用的分子生物學方法雖然對鑒定早期病例及患者預后和治療有重要意義，但同時存在一定的缺點，例如假陽性率高，對血液異常成分或異型淋巴細胞不能及時發現和鑒別，特別是對形態學作為主要診斷標準的淋巴系統疾病不能提供基本信息等。因此，血液形態學仍然應該做為分子生物學技術的重要基礎和補充，兩者互為促進，互相發展才能夠發現新的病種和類型，對血液疾病有更加深入的認識[22-23]。本研究屬于方法學的跨領域使用。應該認識到，生物醫學迅猛發展的今天，多學科、多領域的交流與合作是解決病因病理，治療疑難疾病的重要里程，因此，血液做為臨床輔助檢查的重要目標，應該通過多種渠道和實驗學方法，深入發現及挖掘其自身的價值和潛力，不放過一絲蛛絲馬跡，使其為臨床提供盡可能多而有價值的參考數據。

本研究將液基薄層制片技術和血液形態學結合起來，創建了一種可用于免疫組化的檢測外周學淋巴細胞形態的新方法，該方法將對淋巴系統疾病的血液學檢查創立了新的思路，而且可以應用免疫組化對淋巴瘤亞型進行進一步分類，對淋巴細胞亞群的研究有重要的臨床應用價值，因其取材簡便，制備技術簡單，可為臨床判斷淋巴瘤預后、監測化療指標提供新的方法。

[參考文獻]

[1] 覃小梅，劉勇，陸穎.外周血異型淋巴細胞檢測的臨床意義[J].檢驗醫學與臨床，2011，8（15）：1882-1883.

[2] 周曉倩.液基細胞薄層涂片技術的臨床應用價值[J].中國當代醫藥，2012，19（3）：99-100.

[3] 李小華，張云霄，冬國友，等.全自動制片染色系統制作優質液基細胞片方法的探討[J].山西醫藥雜志，2013，（24）：1433-1434.

[4] 歐陵斌，楊曉斌，柏彬，等.4種液基細胞制片的比較[J].臨床與實驗病理學雜志，2013，29（4）：457-459.

[5] 董靜懿，寧小曉，王蕾，等.上海地區健康成年人外周血T淋巴細胞亞群參考區間調查[J].檢驗醫學，2014，（6）：617-621，627.

[6] 黃柏炎，孫葒，曾潔銘，等.心理應激對正常人外周血T淋巴細胞體外活化表面分子表達的作用[J].中國病理生理雜志，2000，16（3）：229-232.

[7] 徐瑞龍，鄭昭璟.外周血B淋巴細胞免疫表型分析及臨床應用[J].中國實驗診斷學，2004，8（2）：111-114.

[8] 鄭昭璟，徐瑞龍.健康成人外周血B淋巴細胞流式細胞術免疫表型分析：慢性B細胞白血病/淋巴瘤診斷參考值[J].中國實驗血液學雜志，2003，11（4）：398-404.

[9] Mohr S，Liew CC. The peripheral-blood transcriptome： new insights into disease and risk assessment [J]. Trends Mol Med，2007，13（10）：422-432.

[10] 馬芹，張會來，王華慶，等.外周血淋巴細胞絕對數對彌漫大B細胞淋巴瘤患者預后價值的臨床分析[J].中國腫瘤臨床，2014，（8）：503-507.

[11] 陳珍珠，尹青松，魏旭東，等.TRAF6，TAK1和TGF-β基因在彌漫大B細胞淋巴瘤患者化療前后外周血單個核細胞中的表達[J].中國實驗血液學雜志，2014，22（5）：1301-1305.

[12] 王冰潔，岑溪南，梁賾隱，等.外周血EBV-DNA水平對淋巴瘤患者臨床特征及預后的預測意義[C].天津：中國腫瘤內科進展，2014.

[13] 高杰.外周血涂片分類計數白細胞初診48例血液病[J].實驗與檢驗醫學，2012，30（2）：209-210.

[14] 胡昊.98例成人貧血患者的血細胞形態學診斷分析[J]. 國際檢驗醫學雜志，2014，（12）：1640-1641.

[15] 阮雅君，夏朝霞，方建晨.胸水常規及新柏氏液基制片在免疫細胞化學染色中的應用[J].現代實用醫學，2012， 24（9）：1055-1056.

[16] 李艷，陳建萍，何蓉.薄層液基細胞學技術在痰脫落細胞檢查中的臨床應用價值[J].江西醫藥，2013，48（2）：164-166.

[17] 王興波，王靜，馮冬青，等.體腔積液薄層液基細胞涂片免疫組化染色方法研究[J].中國醫藥導報，2013，10（28）：17-19.

[18] 譚永興，江衛民，李艷梅，等.液基細胞制片免疫組化染色在胸腹腔積液診斷中的應用[J].轉化醫學雜志，2014，（3）：147-149.

[19] 陸曉青，陳潔瑛，舒青青，等.宮頸液基薄層脫落細胞聯合HPV及p16檢測在宮頸癌早期篩查中的臨床意義[J].浙江醫學，2014，（13）：1147-1149.

[20] 楊彥華，常宏，于建憲，等.p16^INK4a和Ki-67免疫細胞化學染色在宮頸液基細胞學中的應用價值[J].診斷病理學雜志，2009，（3）：4-6.

[21] 楊彥華.液基細胞學標本中p16^INK4a、Ki67的表達及導流雜交HPV分型在子宮頸癌及癌前病變中的意義[D].青島：青島大學，2008.

[22] 張智慧 孫耘田.免疫細胞化學在細胞病理學中的應用[J].中華病理學雜志，2005，34（10）：672-673.

[23] 盧興國，叢玉隆.應重視和提升傳統血液形態學檢驗診斷水平[J].中華檢驗醫學雜志，2006，29（6）：481-482.

（收稿日期：2015-03-11 本文編輯：程 銘）