苦參素對人肺腺癌A549細胞放射敏感性的影響及其機制

史衛林，李堅，陸建保，陳萍，周玉濤

（1.溧陽市人民醫院呼吸內科，江蘇溧陽213300；2.江蘇大學附屬醫院呼吸內科，江蘇鎮江212001）

苦參素對人肺腺癌A549細胞放射敏感性的影響及其機制

史衛林1，李堅2，陸建保1，陳萍2，周玉濤1

（1.溧陽市人民醫院呼吸內科，江蘇溧陽213300；2.江蘇大學附屬醫院呼吸內科，江蘇鎮江212001）

目的：觀察苦參素聯合放射線照射對人肺腺癌A549細胞增殖率以及DNA依賴性蛋白酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）的兩類結構亞基DNA-PKcs及Ku80 mRNA表達的影響。方法根據不同的處理條件，將A549細胞分為對照組，單純照射組，單純藥物組，藥物聯合照射組。通過CCK-8法檢測細胞增殖率，并應用實時熒光定量PCR技術檢測DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相對表達水平。結果：苦參素明顯抑制A549細胞的增殖，呈時間和劑量依賴性（P＜0.05），其24 h和48 h的半數抑制濃度（IC50）值分別為3.2 g/L和2.4 g/L。單純照射組隨著照射時間的延長和放射線劑量的增加，細胞增殖率明顯下降（P＜0.05）；藥物聯合照射組細胞隨著照射時間的延長，細胞增殖率也隨之明顯下降（P＜0.05）；在同一時間點，藥物聯合照射組細胞增殖率下降比單純照射組更為明顯（P＜0.05）。此外，在單純照射組中，A549細胞DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相對表達水平隨著照射時間的延長和放射線劑量的增加而增高（P＜0.01）；較對照組而言，單純藥物組DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相對表達水平明顯下調（P＜0.01）；與對應的單純照射組比較，藥物聯合照射組DNA-PKcs及Ku80 mRNA相對表達水平明顯下調（P＜0.01）。結論：苦參素對腫瘤細胞具有放射線增敏作用。輻射可明顯增加肺癌細胞DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相對表達水平，苦參素對A549細胞的放射線增敏效應至少部分是與抑制DNA-PKcs及Ku80 mRNA的表達，從而抑制DNA損傷修復有關。

肺癌；苦參素；放射敏感性；DNA依賴性蛋白酶

放療是中晚期肺癌患者的一個重要治療手段。腫瘤細胞受到放射線照射后主要發生堿基損傷、DNA單鏈斷裂、DNA雙鏈斷裂以及DNA-蛋白質交聯等損傷，其中最主要是雙鏈斷裂，而細胞可以修復雙鏈斷裂從而對放射線產生放療耐受。現有研究認為DNA依賴性蛋白酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）通過修復雙鏈斷裂，影響細胞對放射線的敏感性［1］。DNA-PKcs及Ku80是DNA-PK的結構亞基，參與DNA非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復，是研究腫瘤細胞放療敏感性的重要靶點。近年來，雖然腫瘤放療技術已取得較大進展，但仍有部分患者放射治療失敗。而且對放射治療有效的患者復發后再放療效果常常不明顯，究其原因主要與腫瘤細胞對放射線耐受有關。苦參素是中藥苦參的主要活性成分之一，具有放療增敏作用［2］，但機制尚未闡明。本實驗通過觀察苦參素聯合放射線照射對肺癌A549細胞增殖率以及DNA-PKcs、Ku80 mRNA表達的影響，探討苦參素放療增敏的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養基和0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司），苦參素標準品（北京中科儀友化工技術研究院），CCK-8試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司），Trizol試劑盒（美國Invitriogen公司），反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），倒置式生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Clinac 600c 6MV直線加速器（美國Varian公司），HT-2型酶標儀（Austria公司），熒光定量PCR分析儀（美國Stratagene公司），人肺腺癌A549細胞株由江蘇大學醫學院提供。

1.2 苦參素作用于A549細胞后細胞增殖率的測定

取對數生長期的A549細胞，接種至96孔板，每孔100μL（細胞數約5×103/孔），每一實驗組（按苦參素濃度）設6個復孔，培養12 h后移液槍小心吸取上清液，分別將含有苦參素質量濃度為0，0.5，1.0，2.0以及4.0 g/L的培養基100μL加入對應的孔中，其中0 g/L設為陰性對照組，同時設立空白組。然后置于37℃、5%CO2培養箱孵育，分別在培養24 h和48 h后于對應的各孔中加CCK-8試劑10 μL，繼續于37℃恒溫條件下培養1 h，酶標儀上測定450 nm處光密度（D）值。實驗重復3次。用空白組調零后，計算各組細胞增殖率（細胞增殖率=實驗組D值/對照組D值×100%）。

1.3 單純照射和藥物聯合放射線作用后細胞增殖率的測定

根據細胞抑制率，利用SPSS 17.0軟件計算出半數抑制濃度（IC50）值，選擇48 h 20%抑制濃度（IC20）值0.9 g/L作為加藥濃度。將處于對數生長期的A549細胞分為對照組，單純照射組，藥物聯合照射組，照射劑量分為1，2，4和8 Gy。在24 h和48 h分別測定細胞增殖率，測定方法同上。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測細胞DNA-PKcs及Ku80 mRNA的表達

將處于對數生長期的A549細胞分為對照組，單純照射組，單純藥物組，藥物聯合照射組，照射劑量分為1，2，4和8 Gy，單純藥物組與藥物聯合照射組中苦參素質量濃度選定為0.9 g/L。根據實驗分組，接種細胞，在藥物及射線干預后的24，48 h收集細胞，使用Trizol試劑提取RNA，測定RNA濃度，然后進行反轉錄，最后進行PCR擴增。擴增條件：95℃5 min預變性，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。GAPDH：上游引物5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，下游引物5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′，產物長度172 bp；DNA-PKcs：上游引物5′-ATCTGTCATCTGCTGTGTCTTCAAT-3′，下游引物5′-CTGCTTCTCTGGCTTCTTTCCTAA-3′，產物長度197 bp。Ku80：上游引物5′-GCTAATCCTCAAGTCGGCGT-3′，下游引物5′-ATGGAGTCAATCAAAGCATCAACA-3′，產物長度182 bp。以GAPDH作為內參照，定量分析DNAPKcs及Ku80 mRNA的相對表達水平。目的基因相對表達水平的計算公式：2-ΔΔCt=2-（ΔCt目的基因-ΔCt標準值）。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 苦參素對A549細胞增殖率的影響

不同質量濃度的苦參素處理A549細胞后，細胞增殖率隨苦參素作用時間的延長及濃度的增大而下降，呈時間（P＜0.05）和劑量依賴性（P＜0.05）。4種質量濃度的苦參素作用后細胞的增殖率見圖1。24 h的IC50值為3.2 g/L，48 h的IC50值為2.4 g/L，48 h的IC20值為0.9 g/L。

圖1 不同質量濃度苦參素作用后A549細胞的增殖率

2.2 單純照射和藥物聯合照射處理對A549細胞增殖率的影響

如圖2所示，當藥物聯合照射組中苦參素質量濃度設定為0.9 g/L時，隨著照射時間的延長和照射劑量的增加，單純照射組和藥物聯合照射組的A549細胞增殖率明顯下降（P＜0.05）；在同一時間點，與對應的照射組比較，藥物聯合照射組的細胞增殖率明顯下降（P＜0.05）。以上結果表明，苦參素可明顯增加A549細胞對放射線的敏感性。

圖2 不同放射線劑量對兩組A549細胞增殖率的影響

2.3 單純照射和藥物聯合照射作用后A549細胞DNA-PKcs和Ku80 mRNA的相對表達水平

與對照組（對照組中DNA-PKcs和Ku80 mRNA的表達量設定為1）比較，單純照射組DNA-PKcs和Ku80 mRNA的相對表達水平隨著時間的延長和照射劑量的增加明顯增高（P＜0.01），見表1、表2。單純藥物組的DNA-PKcs和Ku80 mRNA相對表達水平比對照組明顯下降（P＜0.01）；在同一時間及同一放射線劑量，藥物聯合照射組的DNA-PKcs和Ku80 mRNA相對表達水平較單純照射組顯著降低（P＜0.01），見表3、表4。結果提示，放射線可以誘導A549細胞DNA-PKcs和Ku80基因表達的增加，而苦參素可下調A549細胞的DNA-PKcs和Ku80 mRNA表達水平。

表1 4種劑量X射線處理后A549細胞DNA-PKcsm RNA的相對表達水平

表2 4種劑量X射線處理后A549細胞Ku80 m RNA的相對表達水平

表3 5種劑量X-射線聯合苦參素（0.9 g/L）處理后A549細胞DNA-PKcsmRNA的相對表達水平

表4 5種劑量X射線聯合苦參素（0.9 g/L）處理后A549細胞Ku80 m RNA的相對表達水平

3 討論

苦參素（氧化苦參堿）來源于豆科植物苦參的干燥根，是中藥苦參的主要生物堿。近年來研究發現，苦參素有多方面的藥理活性，其中抗腫瘤作用受到了廣泛關注。它能夠抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞分化和凋亡，抑制腫瘤新生血管形成和腫瘤侵襲［3-8］。也有少量報道表明其有放療增敏作用［2］，但機制不甚清楚。本實驗結果顯示，苦參素能夠抑制A549細胞的增殖，這一作用呈時間和劑量依賴性。而且與單純照射組比較，苦參素聯合照射組的A549細胞增殖率明顯降低，表明苦參素可增加肺腺癌細胞對放射線的敏感性。

DNA是放射線作用的主要靶點，放射線的直接作用和電離效應產生的自由基共同導致DNA單、雙鏈斷裂損傷，其中以雙鏈斷裂為放射線殺傷腫瘤細胞最重要的機制。當DNA雙鏈受到損傷時，細胞將通過不同的途經啟動應答進行DNA修復以克服損傷。在哺乳動物細胞中，雙鏈斷裂修復有兩條途徑：同源性重組（homologous recombination，HR）和NHEJ，其中NHEJ途徑是主要修復途徑［9］。DNAPKcs基因位于染色體8q11，編碼相對分子質量為469 000的蛋白質，其C-末端結構域和參與信號傳導的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）有同源性［10］。人Ku80基因位于染色體2q33-34，編碼相對分子質量約為86 000的蛋白，參與DNA-PK與其他蛋白的相互作用，它與Ku70緊密結合，形成Ku蛋白［11］。當DNA雙鏈損傷時，2個Ku分子特異性地連接到DNA雙鏈損傷處，分別識別并結合于每一條DNA鏈末端，然后以ATP依賴的方式沿DNA鏈分別向兩端滑動一小段距離，同時Ku本身具有的弱解旋酶活性使兩個斷端局部解鏈，從而形成Ku-DNA復合物吸引DNA-PKcs到損傷部位，位于兩個斷裂末端的DNA-PK蛋白復合體通過各自的氨基端相互作用搭橋，拉近DNA損傷末端，并激活DNA-PKcs的絲/蘇氨酸激酶活性，磷酸化參與NHEJ的一系列蛋白質，對DNA損傷位點進行恰當的剪切和連接，當修復完成后DNA-PK發生自身磷酸化，使2個亞單位從DNA鏈上解離［12-13］。作為DNA-PK復合物的主要功能單位，DNA-PKcs與Ku80是研究腫瘤細胞放療敏感性的重要靶點。

大量研究顯示，DNA-PKcs和Ku80基因或者蛋白高表達的腫瘤細胞對放射線耐受，而低表達則對放射線高度敏感［14-15］。有研究顯示，通過抑制腫瘤細胞DNA-PKcs的表達或抑制其磷酸化，或者抑制Ku80的表達，均可提高腫瘤細胞對放射線的敏感性［16-21］，說明DNA-PKcs和Ku80的表達水平是影響細胞對放射線敏感性的重要因素。本實驗結果顯示，單純用放射線照射后隨著照射時間的延長，照射劑量的增強，肺腺癌細胞DNA-PKcs和Ku80 mRNA的相對表達水平相應增加。這一結果表明，放射線在殺傷肺癌細胞的同時也誘導了DNA-PKcs和Ku80基因的表達增加，NHEJ通路的DNA損傷修復功能被激活，以抵抗放射線對肺癌細胞DNA的損傷作用，同樣證明了DNA-PKcs和Ku80在肺腺癌細胞對放療的耐受中起著重要作用，其表達水平可以作為預測腫瘤對放療敏感性的標志。我們的實驗結果還顯示，單純藥物組中DNA-PKcs和Ku80 mRNA的表達水平下調，藥物聯合照射組與對應的單純照射組相比較，其相對表達水平明顯下調，這也表明了苦參素可下調肺腺癌細胞DNA-PKcs和Ku80的表達水平，通過抑制DNA的修復功能，增加細胞對放射線的敏感性，這也可能是其放療增敏機制之一。

綜上所述，苦參素具有放射線增敏作用，其增敏機制之一可能是通過下調DNA-PKcs和Ku80的表達，抑制細胞DNA損傷的修復功能。苦參素放射線增敏作用的確切機制仍需進一步深入研究。

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Effect of oxymatrine on radiosensitivity of A549 cells and its possiblemolecular mechanism

SHIWei-lin1，LI Jian2，LU Jian-bao1，CHEN Ping2，ZHOU Yu-tao1
（1.Department of Respiratory Medicine，the People′s Hospital of Liyang City，Liyang Jiangsu 213300；2.Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To investigate the mechanism of oxymatrine in enhancing the sensitivity of lung cancer cells to radiation.M ethods：The A549 cellswere divided into control group，radiation group，drug group，drug plus radiation group according to treatment condition.The cell counting kit-8 assay was used to determine proliferation rate.The real-time quantitative PCR assays were conducted tomeasure DNA-PKcs and Ku80 mRNA expression levels at 24 h and 48 h following treatment with oxymatrine，or radiation，or oxymatrine plus radiation.Results：Oxymatrine significantly inhibited the proliferation of A549 cells in a dose and time dependentmanner（both P＜0.05）.IC50of A549 cells for oxymatrine at24 h and 48 h were 3.2 g/L and 2.4 g/L，respectively.The proliferation rates of A549 cells in the radiation group were decreased in a time and dose dependentmanner（both P＜0.05）.At the same time points，the cell proliferation rates in the drug plus radiation group were dropped markedly when compared with the radiation group（P＜0.05）.Additionally，the relative expression levels of DNA-PKcs and Ku80 mRNA were increased in a dose and time dependentmanner in the radiation group（both P＜0.01）.The relative expression levels of DNA-PKcs and Ku80mRNA in the drug plus radiation group were reduced significantly as compared with inthe radiation group（P＜0.01）.Conclusion：Oxymatrine enhanced the sensitivity of A549 cell to radiation，at least partially，by inhibiting DNA-PKcs and Ku80 mRNA expression and damage of DNA damage repairmechanisms.

lung cancer；oxymatrine；radiosensitivity；DNA dependent protein kinase

R734.1 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0207-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150083

溧陽市科技計劃項目（溧科發［2013］5）；江蘇大學醫學臨床科技發展基金資助項目（JLY20120116）

史衛林（1982—），男，江蘇溧陽人，主治醫師，主要從事肺癌分子診斷研究。

2015-04-04 ［編輯］陳海林