病毒載體介導β折疊阻斷肽的表達及其對β淀粉樣蛋白神經毒性的抑制作用

王兵，劉晴晴，夏春林，劉朝暉

（蘇州大學醫學部人體解剖與組織胚胎學系，江蘇蘇州215123）

病毒載體介導β折疊阻斷肽的表達及其對β淀粉樣蛋白神經毒性的抑制作用

王兵，劉晴晴，夏春林，劉朝暉

（蘇州大學醫學部人體解剖與組織胚胎學系，江蘇蘇州215123）

目的：通過病毒載體轉染體外培養的海馬神經元，觀察后者表達分泌性的β折疊阻斷肽（β-sheet breaker peptide，BSB）的生物活性。方法：采用分子克隆技術構建編碼神經營養素4（neurotrophin-4，NT4）信號肽-BSB融合基因的重組腺伴隨病毒（recombinant adeno-associated vrius，rAAV）載體，AAV在包裝細胞系293細胞中進行包裝，蔗糖梯度離心法純化病毒顆粒，斑點雜交法測定重組病毒滴度。MTT檢測及電鏡觀察BSB的生物學效應。結果：成功構建pSSHG/NT4-BSB質粒載體，純化后獲得滴度為3.6×1012～1.8×1013/m L的病毒顆粒。通過病毒感染培養的神經元分泌表達的BSB有效地抑制了β-淀粉樣蛋白（Aβ）的纖維化聚集，明顯降低了Aβ在體外的神經元毒性。結論：采用AAV載體介導的BSB短肽的分泌表達在體外培養的海馬神經元中顯示了良好的生物活性。

阿爾茨海默病；β折疊阻斷肽；信號肽；腺伴隨病毒

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種神經退行性疾病，同時也歸為蛋白質構象病［1］。蛋白質構象病是一類由于組織中特定的蛋白質發生了構象變化進而聚集并沉積所引起的疾病。除AD外，帕金森病、亨廷頓病、人海綿狀腦病以及傳統疾病鐮刀型紅細胞貧血等均屬于蛋白質構象病［2］。雖然不同構象病的臨床和病理表現各異，但共同特征表現為蛋白質的一級結構與正常相同，而二級結構或三級結構發生改變；與生理性蛋白質相比，異常蛋白質中含有較高的β折疊結構，且易聚集形成蛋白質低聚化體和聚集體。構象病所涉及的變構蛋白質包括AD中的β-淀粉樣蛋白（Aβ）、帕金森病中的α-突觸核蛋白（α-synuclein）、海綿狀腦病中的朊蛋白以及鐮刀細胞貧血中的血紅蛋白等［3］。生理狀態的可溶性Aβ為非淀粉樣的無規則卷曲構象，而病理狀態則為獨特的二級結構，即β-折疊構象，易集聚，從而產生沉積并引起AD［4］。由此可見，可通過抑制或者逆轉組織蛋白質的變構來防治該類疾病，如設計一種相關構象的短肽類似物，與蛋白質中發生構象改變的核心部位部分同源并結合，穩定靶構象的生理結構不向β折疊結構轉變，從而抑制Aβ自聚形成聚合體，該短肽類似物稱為β折疊阻斷肽（βsheet breaker peptide，BSB）［5-6］。為此，我們構建腺伴隨病毒（adeno-associated virus，AAV）載體重組信號肽與BSB基因，并通過AAV載體實現基因的有效轉移和長期表達，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 Aβ25～35（北京肽合成中心），MTT、低聚賴氨酸（Sigma公司），DMEM、胰蛋白酶（Gibco公司），pGEM-T Easy質粒（Promega公司），胎牛血清、Bcl-2抗體、腦源性神經營養因子抗體及免疫組織化學染色試劑盒（武漢博士德生物工程公司），E co RⅠ、B am HⅠ限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶（華美生物工程公司）。

1.1.2 實驗動物 取新出生的SD大鼠，無菌取腦并分離神經元。

1.2 設計NT4信號肽-阻斷肽分泌表達框

將阻斷肽KLVFF與神經營養素4（neurotrophin 4，NT4）信號肽序列拼接，構建重組AAV載體質粒pSSHG/NT4-KLVFF。根據目的序列：NaeⅠ克隆酶切位點-內肽酶裂解點-阻斷肽KLVFF序列-終止密碼子TAG-PvuⅡ鑒定酶切位點 Bam HⅠ克隆酶切位點（GC-GCCGGC-GTGGG-AAATTGGTGTTCTTT-TAGCAGCTG-GGATCC-CG，兩端各為兩個保護堿基）設計引物。序列如下：上游引物，GCGCCGGCGTGGGAAATTGGTGTTCTT；下游引物，CGGGATCCCAGCTGCTAAAAGAACACC。T4DNA連接酶連接PCR產物與質粒pGEM-T Easy，轉鈣化菌、提質粒并酶切鑒定，挑選陽性pGEM-T/KLVFF克隆，進行序列測定和分析。已構建好的pBV220/NT4質粒和pGEM-T/KLVFF質粒分別用NaeⅠ和Bam HⅠ行雙酶切，得到含黏性末端的pBV220/NT4信號肽載體和KLVFF目的基因片段，T4DNA連接酶連接，得到NT4信號肽-內肽酶裂解點-阻斷肽KLVFF-終止子的阻斷肽真核分泌專用表達質粒（NT4-KLVFF），連接產物轉鈣化菌、提質粒并酶切鑒定，挑選陽性克隆，最后裝入重組AAV載體質粒pSSHG/NT4-KLVFF。

1.3 包裝重組AAV

復蘇人胚腎293病毒包裝細胞，至細胞生長至80%成片時，用磷酸鈣沉淀法將重組質粒pSSHG/ NT4-KLVFF、包裝質粒pAAV/Ad及腺病毒輔助質粒pFG140共轉染293細胞，3 d后收集病毒，蔗糖梯度離心法進行純化。

1.4 斑點雜交法確定病毒滴度

取50μL純化的病毒液，加入蛋白酶K溶液降解病毒衣殼蛋白，提取病毒DNA。以確定濃度的標準pSSHG/NT4-KLVFF質粒梯度稀釋作為對照，與提取的病毒DNA梯度稀釋點樣于NC膜上，用合成的地高辛標志CMV啟動子探針進行雜交（PCMV，病毒載體質粒pSSHG中采用CMV啟動子作為外源基因的啟動子），68℃，20 h，地高辛與酶復合物于37℃作用30 min，顯色液顯色，與標準質粒對照比較確定病毒DNA濃度。根據1 bp DNA相對分子質量為635，pSSHG/NT4-KLVFF質粒為5.3 kb，則pSSHG/ NT4-KLVFF核酸相對分子質量為5 300×635= 3.37×106，10 ng病毒DNA樣品摩爾量為1×10-8g/3.37×106=3×10-15mol，根據1 mol為6.02× 1023個分子，推算10 ng病毒DNA的分子數目為3× 10-15mol×6.02×1023=1.81×109。

1.5 電鏡觀察分泌表達的阻斷肽抑制Aβ的纖維化聚集

取新生大鼠的腦并分離出海馬，0.25%胰蛋白酶消化。收集分離的海馬神經元并重懸于DMEM中，按1×106/mL的密度接種于培養瓶。第2天在培養基中加入AAV顆粒進行感染，2 d后換液，再次換液時離心取上清液，微孔濾膜過濾去除雜質，將常規培養的神經元上清液與Aβ40肽混合作為對照，將分泌表達阻斷肽KLVFF上清液與Aβ40肽混合，37℃孵育72 h，磷鎢酸負染，電子顯微鏡下觀察細胞纖維化狀態。

1.6 MTT檢測分析阻斷肽對Aβ神經元毒性的保護作用

同“1.5”將分離的海馬神經元接種于96孔板，24 h后添加阿糖胞苷以抑制非神經元生長。將細胞隨機分為對照組、Aβ損傷組和BSB保護組，BSB保護組在培養第3天于培養液中加入AAV顆粒感染神經元，對照組和Aβ損傷組常規換液；3 d后，BSB保護組和Aβ損傷組添加10μL/孔Aβ，使終濃度為20μmol/L。2 d后加MTT，20μL/孔，37℃孵育4 h。每孔加入150μL二甲基亞砜，溶解藍色結晶，振蕩，多孔掃描分光光度計于490 nm波長測定光密度值（D）。

1.7 統計方法

用SPSS 10.0數理統計軟件處理數據，運用組間單因素方差分析檢驗，數據用±s表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NT4信號肽-阻斷肽分泌表達框的設計

根據所需的基因元件及酶切克隆位點，同時符合開放閱讀框（ORF）的原則，設計NT4信號肽-阻斷肽分泌表達框，見圖1。

圖1 NT4信號肽-阻斷肽真核分泌表達框

2.2 KLVFF阻斷肽與NT4信號肽序列的拼接

將pBV220/NT4質粒和pGEM-T/KLVFF質粒分別用NaeⅠ和Bam HⅠ雙酶切，連接后得到阻斷肽真核分泌（NT4-KLVFF）專用表達質粒NT4信號肽-內肽酶裂解點-阻斷肽KLVFF-終止子，見圖2。pBV220/NT4-KLVFF質粒用Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切鑒定，得到3.63 kb pBV220載體片段和270 bp目的基因片段，用PvuⅡ酶切鑒定，得到3.9 kb線性化基因片段，與預期結果相符。見圖3。

圖2 阻斷肽表達質粒pBV220/NT4-KLVFF的構建

2.3 重組AAV載體質粒pSSHG/NT4-BSB的構建

將pBV220/NT4-KLVFF質粒和pSSHG-CMV質粒分別用限制性內切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切，得到NT4-BSB基因片段及線性化的pSSHG載體，T4DNA連接酶連接獲得pSSHG/NT4-KLVFF（圖4）。pSSHG/NT4-KLVFF質粒用Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切鑒定，結果如圖5所示，得到預期的5 020 bp pSSHG載體片段和270 bp目的基因片段，Bam HⅠ單酶切鑒定，得到5 300 bp線性化基因片段。基因序列測定結果顯示，NT4-KLVFF與設計序列完全相符。

圖3 pBV220/NT4-KLVFF質粒酶切鑒定結果

圖4 重組AAV載體質粒pSSHG/NT4-BSB

圖5 pSSHG/NT4-BSB質粒酶切鑒定結果

2.4 病毒滴度的斑點雜交結果

結果顯示，病毒DNA樣品的顯色深度在pSSHG/NT4-BSB質粒標準品的50～100 ng/μL之間（圖6），推算病毒DNA濃度在50～100 ng/μL之間時病毒數量為3.6×109～1.8×1010病毒顆粒/ μL，即病毒滴度為3.6×1012～1.8×1013病毒顆粒/mL。

圖6 病毒滴度的DNA斑點雜交結果

2.5 BSB抗Aβ的神經元保護效應

圖7結果顯示，與對照組相比，Aβ損傷組存活率明顯降低（t=9.37，P＜0.05）；BSB保護組細胞存活率較Aβ損傷組增高（t=8.45，P＜0.05），顯示了分泌表達的BSB對Aβ神經元損傷的抑制作用。圖8顯示，Aβ40肽單獨孵育組孵育7 d后可見Aβ肽凝集形成，以淀粉樣纖維結構為主；共同孵育組中BSB有效地減少了Aβ40肽的聚集，僅有少量淀粉樣纖維相互聚集，纖維周圍伴隨大量的無定形結構，表明分泌表達的BSB能有效地抑制Aβ的纖維化。

3 討論

AD發病機制的中心事件是Aβ以不溶性纖維的形式聚集于細胞外并沉積形成神經炎斑塊［7］。生理情況下，Aβ為可溶性肽，存在于人的體液循環中并具有正常的生理功能，但在AD患者腦內，Aβ含量增高和異常的Aβ增多致其集聚并產生神經毒性。Aβ1-42肽的全長氨基酸序列為DAEFR HDSGY EVHHQ KLVFF AEDVG SNKGA IIGLM VGGVV IA，氨基端為中心疏水區，第16～20個氨基酸殘基為KLVFF，是Aβ分子間相互作用的重要部位。在聚集的淀粉樣纖維中，相鄰Aβ肽鏈的KLVFF序列緊密靠攏形成平行或反向平行的β折疊結構。用親水氨基酸取代KLVFF序列的疏水氨基酸顯示Aβ纖維化能力降低；一些可在體外調節Aβ淀粉樣聚集物形成的調節劑，如金屬離子、蛋白多糖、ApoE等，也是通過KLVFF序列及鄰近的氨基酸殘基而發揮調節作用［8］。研究表明，五肽配基是識別結合序列的最小長度且能通過相似的分子間相互作用有效結合于Aβ，競爭性抑制Aβ分子間的結合，阻止Aβ形成淀粉樣纖維［9］。Tjernberg等［10］和Findeis等［11］等研究證實，五肽配基KLVFF親和力最強，能抑制纖維形成及其引起的細胞毒性。阻斷淀粉樣形成的治療方案優勢在于其不影響任何已知的生物學作用，即不會干擾正常的組織和細胞功能［12-13］。

圖7 各組細胞存活率的比較

圖8 BSB對Aβ纖維化的抑制作用（電鏡×5 000）

許多生物活性肽的含量極低但生理作用非常強，是多種疾病的良好的臨床治療藥物。但是，肽的人工合成成本高，在體內易被分解，生物利用度差，血腦脊液屏障通過率低，大多數不能口服需注射給藥。對此，研究人員在對中樞神經系統疾病肽類治療藥物的開發中進行了多項改善工作，包括進行末端保護、改變手性結構、引入非天然氨基酸等提高穩定性，延長其半衰期；用多胺對肽進行共價修飾提高其透過血腦脊液屏障的能力［14］。本研究中，我們避開肽類藥物的結構改造，嘗試使用病毒載體介導短肽基因在神經元內的表達，以期尋找新的給藥方式使治療短肽能在腦內長期表達起到治療AD的作用。

Aβ發生聚集進而沉積并產生神經毒性主要發生在細胞外，那么我們首先需要解決阻斷肽的分泌表達，致其能夠分泌至細胞外與Aβ作用。為此，我們設計了NT4信號肽與BSB融合表達的策略。NT4信號肽是NT4成熟肽于胞外分泌表達時的一段前導肽，可引導成熟肽出胞并在經過胞膜時通過內肽酶切點切下信號肽，從而將成熟肽分泌至胞外。通過基因序列分析，在NT4內肽酶切點前找到了合適的克隆酶切位點NaeⅠ，可將NT4自身序列切下并連入設計的外源基因。我們已經利用NT4的信號肽進行了多個肽的分泌表達，表明NT4的信號肽序列是一個非常好的引導短肽分泌到細胞外的前導序列［15-16］。AAV載體是近年來采用的高效基因轉移載體，幾乎能感染所有組織來源的分裂和非分裂細胞，尤其神經元這種分化終末細胞最為常用，可將攜帶的目的基因整合至宿主細胞的基因組并得以長期表達。

本實驗中，我們通過構建AAV的阻斷肽分泌表達載體，成功轉染了大鼠海馬神經元，BSB的表達能有效抑制Aβ的纖維化聚集，減輕Aβ對神經元的損傷。基于此，我們以后將進一步探討AAV介導的BSB分泌表達在AD轉基因動物模型中的生物學作用。

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A viral vector expressing secretoryβsheet breaker peptide inhibited Aβneuronal toxicity

WANG Bing，LIU Qing-qing，XIAChun-lin，LIU Zhao-hui
（Department of Human Anatomy&Histology and Embryology，Medical School of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China）

Objective：To observe biological activity of secretoryβsheet breaker peptide（BSB）expressed via a viral vector in cultured hippocampal neurons.M ethods：We constructed the recombinantadeno-associated virus（rAAV）encoding fusion gene of neurotrophin-4（NT-4）signal peptide and BSB bymolecular cloning technique.The viruswere produced in 293 packaging cell lines of the AAV and purified by sucrose gradient centrifugation.The viral titer was determined by dot blot hybridization.The biological effects of expressive BSB in vitro were observed by MTT assay and electron microscopy.Results：The pSSHG/NT4-BSB plasmid was constructed successfully.The physical titer of recombinant AAV was 1×1011-1×1012virions/mL after purification.The BSB，secretive expression in AAV transfected cultured hippocampal neuron，inhibited Aβfibrosis aggregation and significantly decreased the neurotoxicity of Aβin cultured hippocampal neuron.Conclusion：AAV vectormediated secretive expression of BSB peptide displayed effective biological effect in vitro cultured neurons.

Alzheimer′s disease；β-sheet breaker peptide；signal peptide；adeno-associated virus

R393；R749.16 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0212-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150051

王兵（1988—），男，碩士研究生；劉朝暉（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：zhliu@suda.edu.cn

2015-03-19 ［編輯］ 劉星星