Toll樣受體4在成骨細胞共培養體系中對干細胞向破骨細胞分化的影響及機制

朱華榮，徐曉峰，陳奇，吳巍，魏長寶，曹學書

（1.江蘇大學附屬醫院骨科，江蘇鎮江212001；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院骨科，湖北武漢430030）

Toll樣受體4在成骨細胞共培養體系中對干細胞向破骨細胞分化的影響及機制

朱華榮1，徐曉峰1，陳奇1，吳巍2，魏長寶1，曹學書1

（1.江蘇大學附屬醫院骨科，江蘇鎮江212001；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院骨科，湖北武漢430030）

目的：探索Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）-4在成骨細胞共培養體系中對干細胞向破骨細胞分化的影響及機制。方法：Percoll密度梯度離心法分離原代大鼠骨髓間充質干細胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs），流式細胞術鑒定細胞表面標志物CD34、CD44、CD54、CD90。用Transwell小室建立干細胞（上室）-成骨細胞（下室）共培養體系，在此體系下對BMSCs進行破骨細胞誘導培養。將共培養體系分為TLR-4激活組和空白組，前者以TLR-4激動劑LPS（10 ng/mL）激活，后者加入等體積PBS。在誘導培養第6天，對上室細胞行抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色，計數并比較各組破骨細胞數。同時，蛋白質印跡檢測各組下室細胞懸液中核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）的蛋白表達，觀察電泳條帶并行定量分析。結果密度離心法獲得原代大鼠BMSCs，流式細胞分析檢測顯示CD34陰性、CD44、CD54和CD90陽性。TRAP染色陽性細胞為破骨細胞，細胞計數顯示，TLR-4激活組破骨細胞數明顯多于空白組（t=13.556，P＜0.05）。蛋白質印跡結果顯示，TLR-4激活組RANKL的表達明顯多于空白組（t=17.630，P＜0.05）。結論：在成骨細胞共培養體系下，激活TLR-4能夠促進BMSCs向破骨細胞分化，其機制可能與TLR-4促進成骨細胞分泌RANKL有關。

干細胞；Toll樣受體-4；破骨細胞；核因子κB受體活化因子配體

干細胞定向分化的調節是近年來的研究熱點之一，許多信號分子參與其中，Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）就是其中之一。TLR不僅能調節干細胞的增殖［1］，還能調節干細胞向成骨方向的分化［2］。我們前期實驗結果表明，TLR-4作為干細胞表面主要的TLR亞型之一，在大鼠骨髓間充質干細胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨過程的不同階段所起的作用也不同［3］。脂多糖是革蘭陰性菌細胞壁的成分，能夠通過抗原抗體反應特異性地激活TLR-4，是TLR-4的特異性激動劑。LPS激活的TLR-4能夠促進BMSCs分化為成骨細胞，但在成骨細胞礦化形成骨細胞的階段，激活的TLR-4則起抑制作用，推測可能與TLR-4參與調節破骨細胞的分化有關。為了證實該假設，我們設計了本實驗，研究在成骨細胞共培養體系下，TLR-4對BMSCs向破骨細胞分化的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

成年SD大鼠（清潔級）8只，雌雄不限，90～100 g，由江蘇大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK（蘇）2013-0036。L-DMEM、H-DMEM（Hyclone，美國），脂多糖（Sigma，美國），大鼠成骨細胞株（ATCC，美國），胎牛血清（Gibco公司，美國），胰蛋白酶（Amersco，美國），雙抗（1∶1的青霉素和鏈霉素，華北制藥），Percoll細胞分層液（Pharmacia公司，美國），多聚賴氨酸玻片（Fisher公司，美國），羊抗大鼠CD34、CD44、CD54、CD90抗體（Santa Cruz公司，美國），SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德），Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國），逆轉錄試劑盒（ToYoBo公司，日本），酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒、DMSO、DEPC、溴化乙啶、溴酚藍、瓊脂糖（Sigma公司，美國），Transwell小室（12孔，8μm，Corning公司，美國）；CO2恒溫培養箱（Thermo公司，美國），DMI4000B倒置相差熒光顯微鏡（Leica公司，德國），凝膠成像分析系統（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養及傳代 取清潔級SD大鼠，頸椎脫位法處死，于75%乙醇中浸泡15 min。無菌條件下解剖并取出四肢長管骨。以L-DMEM培養液（10%胎牛血清）將骨髓組織沖出髓腔后，均勻吹打制成懸液，加入含Percoll分層液（1.077 g/ mL）的離心管，體積比為1∶1，1 500 r/min離心20 min。吸取離心管中層白色細胞帶中的細胞，PBS沖洗3次。將細胞置于培養皿中，加入培養液，調整細胞密度至2×105/mL，分別接種于培養瓶中，放入培養箱中，37℃，5%CO2孵育。每3 d更換1次培養液，直至細胞長滿瓶底80%時傳代。傳至第3代，備用。

1.2.2 BMSCs的鑒定 取第3代BMSCs，以0.1 mmol/L胰酶消化后制成單細胞懸液，密度為107/ mL，加入EP管（100μL），分別加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗鼠單克隆抗體CD34、CD44、CD54、CD90；同型對照管分別加入同量的抗鼠FITC-IgG，冰上避光孵育30 min，PBS洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，分別加入500μL PBS重新制成細胞懸液，流式細胞儀分析。

1.2.3 BMSCs和成骨細胞的共培養、分組及破骨細胞誘導 取Transwell小室（12孔/板，孔徑為8 μm，未鋪基質膠），以無血清L-DMEM平衡1 h。下室加入成骨細胞懸液50μL（1×106/mL），上室加入BMSCs懸液50μL（1×104/mL）。分為TLR-4激活組和空白組，每組12孔，其中TLR-4激活組在下室中加入TLR-4激動劑脂多糖（Sigma公司，L2630-10MG 10 ng/mL）50μL?？瞻捉M加入等體積PBS。兩組均在上室中加入破骨細胞誘導培養液培養［胎牛血清20%，25 ng/mL GM-CSF，10-8mol/L 1，25（OH）2D3］。

1.2.4 TRAP染色檢測破骨細胞 在培養第6天，分別取2組上室細胞懸液制成細胞爬片，固定液固定（37℃，30 s），37℃去離子水漂洗1 min。將配置好的染色液（快速石榴石型堿溶液5μL，亞硝酸鹽溶液5μL，萘酚AS-BI磷酸溶液5μL，醋酸鹽溶液20μL，37℃預熱的去離子水450μL，酒石酸鹽溶液10μL）加入培養皿中預熱至37℃，放入細胞爬片，37℃避光孵育1 h，去離子水漂洗1 min。堿性自來水沖洗3～5 min，直至核呈藍色。自然晾干，甘油明膠封片，顯微鏡觀察，細胞計數儀計數，定量分析。

1.2.5 共培養體系中RANKL檢測 在培養第6天，分別取2組下室細胞懸液，以β-肌動蛋白作為內參，蛋白質印跡法檢測核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）的蛋白表達，蛋白條帶用FluorChem FC3軟件分析。

1.3 統計學分析

以SPSS 16.0進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs的鑒定

原代BMSCs形態較為一致，呈短梭形或多邊形，5～7 d后有明顯集落形成，10 d左右細胞出現融合，呈成纖維細胞樣，漩渦狀或螺旋狀排列。傳代培養的BMSCs呈長梭形，形態更均一。見圖1。細胞生長旺盛，4 d左右細胞融合達90%，7 d左右生長減緩。實驗中第3代細胞活性最佳，第5代以后逐漸老化，故選擇第3代細胞研究。

流式細胞分析結果顯示，細胞表面CD34呈陰性，CD44、CD54、CD90呈陽性（圖2），證實分離培養所得細胞為BMSCs。

圖1 大鼠BMSCs的形態（×40）

2.2 破骨細胞的TRAP染色及計數分析

TRAP染色結果呈陽性，胞質中出現紅色沉淀，提示為破骨細胞（圖3）。定量計數各組每孔破骨細胞數目，TLR-4激活組平均破骨細胞數（55.83± 2.44）明顯多于空白組（37.50±2.20），差異具有統計學意義（t=13.556，P＜0.05）。由此表明，在成骨細胞共培養環境下，激活TLR-4能夠促進BMSCs分化為破骨細胞。

圖2 流式細胞術鑒定大鼠BMSCs

2.3 共培養體系中RANKL的蛋白表達

蛋白質印跡結果表明，TLR-4激活組的RANKL表達明顯強于空白組（t=17.630，P＜0.05），說明在成骨細胞共培養體系中，激活TLR-4能夠促進RNAKL的表達。見圖4。

3 討論

圖3 破骨細胞的鑒定（TRAP染色×200）

骨改建是成熟骨組織形成過程中的重要環節，由成骨細胞和破骨細胞協同完成。破骨細胞主要起骨吸收作用，溶解不成熟以及老化凋亡的骨細胞，成骨細胞起成骨作用，形成新的骨細胞。成骨細胞和破骨細胞相互作用，共同維持骨代謝的動態平衡。TLR是細胞表面一類重要的模式識別受體，屬于I型跨膜蛋白，參與免疫啟動、炎性調節、細胞增殖等許多生理機能的調節，TLR-4是人類干細胞表面主要表達的主要亞型之一［4］。在成骨細胞和破骨細胞協同參與的骨代謝過程中，TLR-4起重要作用。一方面，TLR-4抑制破骨細胞中Wnt/β-certin通路，從而抑制成骨細胞的礦化［5］，這與我們前期研究的結果相一致［3］；另一方面，TLR-4能夠下調破骨細胞前體細胞上的RANK的表達，抑制破骨細胞的形成［6］。

圖4 各組RANKL蛋白的表達

但骨代謝的過程并非在破骨細胞單獨存在的孤立微環境中完成的，TLR-4對成骨細胞的作用可能影響破骨細胞的分化。Vijayan等［7］研究發現，抑制破骨細胞前體細胞的TLR-4/MyD88/NF-κB通路能夠降低骨丟失引起的骨質疏松。而Grevers等［8］研究發現激活TLR-4能夠增強破骨細胞的骨吸收作用。本實驗結果顯示，在成骨細胞共培養的環境中，TLR-4激活組TRAP染色陽性的破骨細胞較空白組明顯增多（P＜0.05），說明在成骨細胞共培養體系中，激活TLR-4能夠促進BMSCs向破骨細胞分化，其機制可能與RANKL/RANK通路的活化有關。RANKL/RANK通路是調節破骨細胞分化、激活和凋亡的重要信號通路［9］，可以通過NF-κB，JNK以及p38等下游信號通路促進破骨細胞的分化［10］。而骨保護素（osteoprotegerin）則通過競爭性結合RANKL抑制RANKL/RANK通路，從而抑制破骨細胞的形成［11-12］。激活的TLR-4能夠誘導干細胞分泌IL-6、IL-8和TNF-β等炎性因子［13］，而這些炎性因子能促進成骨細胞分泌RANKL，從而促進干細胞向破骨細胞分化［14］。本實驗構建的成骨細胞共培養體系中，TLR-4激活組的RANKL表達明顯強于空白組（P＜0.05），說明激活TLR-4能夠提高成骨細胞共培養環境中RANKL的蛋白表達量。

綜上所述，在成骨細胞共培養環境下，激活TLR-4能夠促進BMSCs向破骨細胞分化，其機制可能與激活TLR-4促進成骨細胞分泌RANKL，從而活化RANKL/RANK通路有關。

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Effects and mechanism of Toll like receptor-4 in osteoclastgenesis of stem cells in co-culture system w ith osteoblast

ZHU Hua-rong1，XU Xiao-feng1，CHEN Qi1，WUWei2，WEIChang-bao1，CAO Xue-shu1
（1.Department of Orthopedics，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Department of Orthepeadic，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan Hubei430030，China）

Objective：To investigate the effect of Toll like receptor（TLR）-4 to osteoclastgenesis of stem cells to osteoclasts in co-culture system with osteoblast，and to research the probably mechanism.M ethods：Bonemarrow mesenchymal stem cells（BMSCs）of ratwere abstracted with percoll density gradient centrifugationmethod.Surfacemaker CD34，CD44，CD54，and CD90 were identified with flow cytometry.BMSCs（upper cell）-osteoblasts（lower cell）co-culture system was established with Transwell cells，BMSCswere induced to osteoblasts in this system.Co-culture system were divided into TLR-4 activated group and blank group.Cells in TLR-4 activated group were activated by LPS（10 ng/mL），cells in blank group were treated with PBS of the same volume.After 6 days culture，tartrate resistant acid phosphatase（TRAP）stainingwas performed to examine osteoclasts in the lower cell.Osteoclasts numbers in each group were counted and compared.Meanwhile，western blotting was performed to investigate the expression of receptor activator for nuclear factor-κB ligand（RANKL）.Results：BMSCs of ratwere abstracted with density gradient centrifugation method.Surfacemaker CD34 was negative，while CD44，CD54，and CD90 were positive.TRAP staining positive cell was osteoclasts.Osteoclasts numbers in each group were counted，itwas obviously higher in TLR-4 activated group than that in blank group（t=13.556，P＜0.05）.Results of western blotting showed RANKL expression in TLR-4 activated group was higher than that in blank group（t =17.630，P＜0.05）.Conclusion：In“BMSCs-osteoblasts”co-cultured system，activation of TLR-4 is benefit to the osteoclastgenesis of stem cells.The promotion of TLR-4 to the secretion of RANKLmay be the mechanism.

stem cells；Toll like receptor-4；osteoclast；receptor activator for nuclear factor-κB ligand

R329.2 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0221-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140318

朱華榮（1984—），男，碩士研究生；陳奇（通訊作者），主治醫師，E-mail：jackiechanoth@163.com

2014-12-09 ［編輯］ 劉星星