血漿miRNA-155和miRNA-625用于非小細胞肺癌診斷的臨床評價

費玲，李堅，朱立歡，林杰，何清

（1.江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.解放軍101醫(yī)院檢驗科，江蘇無錫214001）

血漿miRNA-155和miRNA-625用于非小細胞肺癌診斷的臨床評價

費玲1，李堅1，朱立歡1，林杰2，何清2

（1.江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.解放軍101醫(yī)院檢驗科，江蘇無錫214001）

目的：探討測定患者血漿miRNA-155和miRNA-625表達水平用于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）臨床診斷的可行性。方法：應用熒光定量RT-PCR法檢測49例NSCLC患者及55例肺部良性疾病患者血漿中miRNA-155和miRNA-625的表達水平。構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線，根據(jù)這兩個miRNAs的ROC曲線下面積判斷其診斷NSCLC的效能，并與血清癌胚抗原比較，評價它們在NSCLC診斷中的臨床價值。結(jié)果：NSCLC患者血漿中miRNA-155的表達水平明顯高于肺良性疾病患者（P=0.000），miRNA-625的表達水平則明顯低于肺良性疾病患者（P=0.000）。NSCLC患者血漿miRNA-155和miRNA-625的表達水平與腫瘤的臨床分期明顯相關（P=0.008，0.025），miRNA-625亦與患者性別相關（P=0.024），而與其他臨床特征無明顯相關性。根據(jù)ROC曲線取miRNA-155和miRNA-625用于診斷NSCLC的臨界值分別為2.736和0.699，獲得診斷的敏感性分別為75.5%和73.4%，特異性分別為74.5%和70.9%。血清癌胚抗原含量診斷NSCLC的敏感性低于血漿miRNA-155和miRNA-625（P=0.004，0.007），特異性相似。結(jié)論：血漿miRNA-155和miRNA-625可作為分子標志物用于臨床診斷NSCLC。

非小細胞肺癌；miRNA-155；miRNA-625；血漿；診斷

肺癌是導致全球癌癥死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人數(shù)超過100萬，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%以上，包括腺癌、鱗癌和大細胞癌。盡管近年來在肺癌影像學檢查及靶向治療等方面取得了較大進展，但NSCLC5年總生存率仍不足15%［1］。缺乏有效的早期診斷是NSCLC預后不佳的主要原因。多數(shù)患者在臨床確診時已屬中晚期，失去了根治性手術的機會。胸片和CT等檢查特異度低，而現(xiàn)有的血液腫瘤標志物對于肺癌診斷的敏感度較低，缺乏早期診斷的效能。因此，探尋高敏感度和高特異度的標志物成為肺癌早期診斷及治療的迫切需求。近來研究表明，一些特定的microRNAs（miRNAs）與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，在肺癌的發(fā)生過程中起促癌或抑癌作用，可作為肺癌診斷和治療的靶點。

miRNA是長度為21～25 nt的RNA分子，可特異性識別靶mRNA并調(diào)控編碼基因的表達，通過促進mRNA降解或抑制基因轉(zhuǎn)錄進而影響mRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的表達。miRNA參與調(diào)節(jié)多種生物學過程，如細胞分化、增殖、代謝和凋亡等［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，不同的腫瘤具有不同的miRNA表達譜，某些miRNAs還可在某一種腫瘤中特異性表達［4］。此外，機體的各種體液中，包括血漿、痰液、胸液等等，有大量可檢測的細胞外miRNAs，其穩(wěn)定存在且不易被RNA酶降解，使得miRNA作為肺癌的診斷和預后評估的分子標志物成為可能［5］。

本研究結(jié)合肺癌組織中miRNA表達的相關文獻報道，采用實時熒光定量PCR法測定49例NSCLC患者及55例肺部良性疾病患者血漿中miRNA-155及miRNA-625的表達，并評價其診斷NSCLC的臨床價值。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇2012年6月至2014年6月在江蘇大學附屬醫(yī)院及解放軍第101醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院的NSCLC患者，共49例，均為未接受過任何抗腫瘤治療的新發(fā)初診病例，肺部轉(zhuǎn)移性腫瘤患者除外。所有入選患者均經(jīng)病理組織學（組織標本取自纖維支氣管鏡活檢、經(jīng)皮肺穿刺針吸活檢、淋巴結(jié)活檢以及手術切除）檢查確診為NSCLC。其中，鱗癌23例，腺癌26例；男41例，女8例；年齡38～81歲，平均年齡63歲。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2002年制定的TNM分期標準，Ⅰ期7例、Ⅱ期5例、Ⅲ期18例、Ⅳ期19例。另選擇同期住院的55例肺部良性疾病者作為對照，包括肺炎24例，慢性阻塞性肺病10例，支氣管擴張7例，肺結(jié)核4例，間質(zhì)性肺病4例，肺囊腫2例，支氣管哮喘、炎性假瘤、肺神經(jīng)鞘瘤和肺膿腫各1例。為評價研究結(jié)果的穩(wěn)定性，同時選取健康志愿者21例血標本作為對照（樣本miRNA校對值）。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 用枸櫞酸鈉抗凝管收集患者外周血4 mL，4℃放置不超過4 h，2 500 r/min離心10 min，留取血漿。用去核酸酶的1.5 mL EP管分裝，每管600μL，-80℃長期凍存。另將采集血標本的一部分送醫(yī)院醫(yī)學檢驗科測定血清癌胚抗原，根據(jù)試劑盒說明書標示，癌胚抗原的正常上限為5 μg/L。

1.2.2 RNA提取 采用美國Ambion公司的mir-VanaPARIS Kit（AM1556），按照說明書要求取600 μL血漿提取總RNA，用U-2800紫外分光光度儀測定其濃度及純度，-80℃保存。

1.2.3 cDNA的合成 采用日本TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A），按照銳博公司miRNA莖-環(huán)結(jié)構(gòu)引物的使用說明書，取2μg總RNA（體積最大為9μL）、RT引物工作液2μL和無RNA酶水定容至11μL，混勻，瞬時離心，70℃放置10 min，冰上孵育2 min，再依次加入5×PrimeScript緩沖液7μL、PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶混合液Ⅰ1μL和無RNA酶水6μL，于PCR儀42℃孵育60 min，70℃孵育10 min，反應結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，冰上冷卻，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實時熒光定量PCR 采用日本TaKaRa公司的實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM（RR420A），按照銳博公司的miRNA莖-環(huán)結(jié)構(gòu)引物的使用說明書，依次加入SYBR熒光染料混合液9μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL、ROX校正染料Ⅱ0.4 μL、上游引物和下游引物各0.8μL（miR-625各0.5 μL），最后用無RNA酶水配成20μL的PCR反應體系。循環(huán)參數(shù)：95℃20 s，95℃10 s，60℃20 s，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，用Mx3000p定量PCR儀得到Ct值。應用2-△△Ct的方法計算所測血漿標本miR-155和miR-625的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，所有計量數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)性檢驗，以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。計數(shù)數(shù)據(jù)的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線，通過計算出的ROC曲線下面積評估兩類血漿miRNAs水平對NSCLC的診斷效能，并通過計算敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及準確性來評價其在NSCLC診斷中的臨床價值。

2 結(jié)果

2.1 血漿中miRNA-155和miRNA-625的表達水平

NSCLC患者血漿中miRNA-155相對表達量明顯高于肺良性疾病患者，而miRNA-625的表達水平則明顯低于肺良性疾病者（P均=0.000）。NSCLC患者血清癌胚抗原水平明顯高于肺良性疾病者（P=0.002），見表1。

表1 兩組患者血漿中不同標志物的表達水平

2.2 NSCLC患者血漿中miRNA-155和miRNA-625表達與臨床病理特征的關系

Ⅲ期和Ⅳ期NSCLC患者血漿中miRNA-155的表達水平明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期患者（P=0.008），而miRNA-625的表達水平則明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期患者（P=0.025），表明兩類分子標志物的水平與患者腫瘤的TNM分期相關。同時miRNA-625的表達水平與患者性別相關（P=0.024），但未發(fā)現(xiàn)與其他臨床病理學特征存在相關性。miRNA-155的表達水平與患者的年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤的組織學類型及分化程度均無相關性，見表2。

表2 NSCLC患者血漿m iRNA-155和m iRNA-625水平與臨床病理特征的關系

2.3 血漿miRNA-155和miRNA-625檢測對NSCLC的診斷效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血漿miRNA-155診斷NSCLC的曲線下面積（AUC）為0.835（SE=0.039，95%CI=0.759～0.911），取2.736為診斷NSCLC的臨界值，其敏感度和特異度分別為75.5%和 74.5%。血漿miRNA-625診斷NSCLC的AUC為0.781（SE=0.046，95%CI=0.690～0.871），取0.699為miRNA-625診斷NSCLC的臨界值，診斷敏感度和特異度分別為73.4%和70.9%。由此可見，這兩類血漿miRNAs表達水平對NSCLC具有較高的診斷效能，見圖1、圖2。

圖1 血漿m iRNA-155 ROC曲線

圖2 血漿m iRNA-625 ROC曲線

2.4 血漿miRNA-155和miRNA-625檢測與血清癌胚抗原檢測的比較

由表3可見，血漿miRNA-155和miRNA-625診斷NSCLC的特異性與血清癌胚抗原相似，但診斷敏感性明顯高于血清癌胚抗原（P=0.004，0.007）。聯(lián)合血漿miRNA-155和miRNA-625的串行試驗可提高診斷特異度，并行試驗可提高診斷的敏感度。

3 討論

腫瘤標志物的檢測在腫瘤的普查、高危人群隨訪觀察、早期診斷、評估療效、判斷病情預后和轉(zhuǎn)歸等方面有較大的應用價值。目前較常見的腫瘤標志物包括腫瘤抗原、酶類、激素類、多胺類、癌基因產(chǎn)物等，但因敏感性和特異性不高，臨床應用效果還存在著明顯不足。miRNA的研究是腫瘤分子生物學領域中發(fā)展最快的項目之一，其通過基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，在細胞增殖、分化、凋亡及個體發(fā)育等生命過程中起重要作用。miRNA不僅在組織中表達，而且血漿或血清中的含量亦十分豐富，其以受保護的狀態(tài)存在于血漿或血清中，且不易被RNA酶降解，故可直接從血漿或血清標本中檢測出［4-5］。Chen等［6］發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中miRNA表達譜與健康者存在較大差異，與健康對照者比較，NSCLC患者血清中有28種miRNAs缺失，但有63種新的miRNAs可測出。此外NSCLC患者的血清miRNA表達譜與血細胞明顯不同，有57種miRNAs同時存在于血清和血細胞中，另有76種miRNAs僅存在于NSCLC患者血清中。而健康者血清miRNA表達譜與血細胞基本相同［7］，因此，血標本miRNA檢測在NSCLC診斷中的價值引起了人們的關注。

表3 血漿m iRNA-155、m iRNA-625和血清癌胚抗原檢測診斷NSCLC的評價

miRNA-155位于人21號染色體上BIC基因的第3個外顯子內(nèi)。Lagos-Quintana等［7］在小鼠的mRNA克隆研究中發(fā)現(xiàn)，BIC轉(zhuǎn)錄本的小種系保守區(qū)域編碼miRNA-155。miRNA-155在人B細胞淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中高表達，常預示預后不良［8-11］。Yanaihara等［3］采用基因芯片微量測定法分析104對原發(fā)肺癌組織和肺癌旁正常組織標本，發(fā)現(xiàn)兩組標本中有43種miRNA存在表達差異，miRNA-155在肺癌組織標本中表達上調(diào)；用熒光定量PCR法進一步分析miRNA-155表達與肺癌患者生存期的關系，結(jié)果顯示miRNA-155高表達者的總生存期明顯縮短，提示肺癌組織miRNA-155表達可作為肺癌診斷與預后判斷的標志物。Wang［12］等采用納米技術測定血漿中miRNA-155表達，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血漿miRNA-155含量明顯高于健康對照者。Zheng等［13］研究了一組肺癌（包括NSCLC、小細胞肺癌及類癌）患者血漿中miRs表達，結(jié)果顯示miR-155、miR-197和miR-182在肺癌組織中呈高表達，在各期肺癌患者血漿中的水平均較無癌對照者明顯升高。聯(lián)合這3類血漿miRNAs測定鑒別診斷肺癌與無癌對照者的敏感度和特異度為81.33%和86.76%；研究同時發(fā)現(xiàn)合并有轉(zhuǎn)移的肺癌患者血漿miR-155和miR-197水平明顯高于無轉(zhuǎn)移者，接受化療后獲臨床效果者miR-155和miR-197水平明顯下降。Roth等［14］研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血清中miR-10b、miR-34a、miR-141、miR-155的表達水平高于良性肺病患者和健康對照者，其中miR-155鑒別肺癌患者與良性肺病者和健康對照者的AUC分別為0.823和0.858。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者血漿miR-155水平明顯高于良性肺病患者，鑒別兩者的AUC為0.835，同時血漿miR-155水平與NSCLC患者臨床分期呈相關性，Ⅲ、Ⅳ期患者表達水平明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者，與上述報道結(jié)果相符。

劉楠啟等［15］的研究顯示結(jié)直腸癌組織中miRNA-625表達明顯低于癌旁正常黏膜組織，其低表達與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移密切相關，且5年生存率低于miRNA-625高表達者。Wang等［16］研究顯示，與癌旁非腫瘤組織和正常胃黏膜上皮細胞株比較，胃癌患者腫瘤組織和胃癌細胞株中miRNA-625表達明顯下降，且miRNA-625低表達患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，進一步的體內(nèi)外實驗證明miRNA-625能抑制胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Roth等［17］研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清miRNA-625水平明顯低于良性肺病患者和健康對照者。此外，大細胞肺癌和吸煙患者血清中miRNA-625水平明顯低于腺癌和不吸煙患者。本研究亦顯示NSCLC患者血漿中miRNA-625水平明顯低于良性肺病患者，用于診斷NSCLC的AUC為0.781，與Roth等［17］結(jié)果相似。本研究中miRNA-625的表達與患者臨床分期及性別相關，而與年齡、吸煙、腫瘤組織學類型及分化程度無相關性。導致兩個研究結(jié)果部分差異的原因尚不清楚，可能與入組病例不同（本研究組無大細胞肺癌）、標本類型、實驗方法差異相關。

本研究同時比較了血漿miRNA-155、miRNA-625和血清癌胚抗原診斷NSCLC的敏感度和特異度，在特異度相似的前提下，miRNA-155和miRNA-625的敏感度明顯高于癌胚抗原，提示這兩類血漿miRs有可能成為診斷NSCLC新的標志物。此外，必須認識到診斷NSCLC的金標準仍是病理組織學和細胞學，血液腫瘤標志物尚不能作為確診依據(jù)。然而，循環(huán)miRNA能夠在出現(xiàn)臨床癥狀或確診之前在分子水平發(fā)出預警，可為進一步檢查指明方向。高特異度及敏感度的腫瘤標志物結(jié)合影像學等檢查，將進一步提高肺癌篩查和診斷的效果。

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Clinical utility of plasma m iRNA-155 and m iRNA-625 detection in the diagnosis of non-small cell lung cancer

FEILin1，LIJian1，ZHU Li-huan1，LIN Jie2，HE Qin2
（1.Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Department of Clinical Laboratory，the Liberation Army 101 Hospital，Wuxi Jiangsu 214001，China）

Objective：To evaluate the clinical utility of plasmamiRNA-155 and miRNA-625 expression asmolecularmarkers in the diagnosis of non-small cell lung cancer（NSCLC）.M ethods：Fluorescent quantitative RT-PCR was used to detect the expressions ofmiRNA-155 and miRNA-625 in plasma samples from 49 patientswith NSCLC and 55 patientswith benign lung disease（BLD）.Receiver operating characteristics（ROC）curves of the twomiRNAs were constructed to assess diagnostic power for NSCLC.The sensitivity and specificity of plasma miRNA-155 and miRNA-625 expression for diagnosing NSCLC were calculated，and compared with serum carcinoembryonic antigen（CEA）.Results：The plasma miRNA-155 levels in NSCLC patientswere significantly higher than those in BLD patients（P=0.000），whereas the plasmamiRNA-625 levels in NSCLC patientswere significantly lower than those in BLD patients（P=0.000）.For patientswith NSCLC，the plasmamiRNA-155 and miRNA-625 expression levelswere significantly correlated with tumor clinical（TNM）stage（P=0.008 and P=0.025，respectively）.In addition，plasma miRNA-625 levelswere also correlated with NSCLC patient gender（P=0.024）.No correlation was found between the plasmamiRNA-155 and miRNA-625 levels and other clinicopathologic characteristics.According to the ROC curve analysis，cut-off values of plasmamiRNA-155 and miRNA-625 levels in differentiating NSCLC from BLD were defined as2.736 and 0.699，respectively.For the diagnosis of NSCLC，the sensitivity andspecificity was 75.5%and 74.5%formiRNA-155，73.4%and 70.9%for miRNA-625，respectively.The sensitivity of CEA was inferior tomiRNA-155 and miRNA-625（P=0.004 and P=0.007），although the CEA specificity was similar to the twomiRNAs for diagnosing NSCLC.Conclusion：PlasmamiRNA-155 and miRNA-625 expression might be used as themolecularmarkers for the diagnosis of NSCLC.

non-small cell lung cancer；miRNA-155；miRNA-625；plasma；diagnosis

R734.2 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0236-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150002

費玲（1983—），女，碩士研究生；李堅（通訊作者），教授，主任醫(yī)師，博士生導師，E-mail：lijian541226@163.com

2015-01-06 ［編輯］ 劉星星