弓形蟲表面抗原1、棒狀體蛋白18真核表達載體的構建與體外表達

吳臘梅，吳婷，吳亮，王曉，蘇丹華，劉原，陶思佳，魏逸青，姜旭淦，陳盛霞，曹建平

（1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，上海200025）

弓形蟲表面抗原1、棒狀體蛋白18真核表達載體的構建與體外表達

吳臘梅1，吳婷1，吳亮1，王曉1，蘇丹華1，劉原1，陶思佳1，魏逸青1，姜旭淦1，陳盛霞1，曹建平2

（1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，上海200025）

目的：構建剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）表面抗原1（surface antigen 1，SAG1）及棒狀體蛋白18（rhoptry protein 18，ROP18）的真核表達重組質(zhì)粒，并在真核細胞中表達目的蛋白。方法：設計SAG1、ROP18的特異引物，采用RCR技術從弓形蟲RH株基因組DNA中擴增編碼SAG1、ROP18基因片段，經(jīng)克隆至pTG19-T載體后，亞克隆至真核表達載體p3×FLAG-Myc-CMVTM-24，構建真核表達重組質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18。將構建好的真核表達重組質(zhì)粒轉染人腎上皮細胞系293-T細胞，分析轉染細胞的表達情況。結果：PCR擴增弓形蟲SAG1和ROP18基因片段分別為1 011 bp和1 665 bp，與預期大小相符。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定結果均正確，通過RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡技術鑒定出重組質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3× FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18在293-T細胞中表達。結論：成功構建了真核表達質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18，該重組質(zhì)粒能夠在真核細胞中表達目的蛋白。

剛地弓形蟲；SAG1；ROP18；真核表達質(zhì)粒

弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性細胞內(nèi)寄生蟲，可引起人獸共患弓形蟲病［1］。弓形蟲病也是最常見的機會性致病寄生蟲病［2］，腫瘤患者、HIV以及AIDS人群弓形蟲抗體陽性率分別高達63%、44.8%和95.0%［3-4］。另有研究表明，弓形蟲可影響患者的智力發(fā)育，與精神分裂癥的發(fā)生存在聯(lián)系［5］。常見的經(jīng)濟家畜如牛、羊和豬等普遍易感弓形蟲，每年由弓形蟲感染造成的家畜流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失［6-7］。貓、狗等寵物也易感染弓形蟲，是人類感染弓形蟲的重要傳染源［8-9］。鑒于弓形蟲病對人類健康造成的嚴重危害和對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟損失，研制具有免疫保護作用的疫苗成為防治弓形蟲病的一種有效手段。速殖子表面抗原（surface antigen，SAG）1是最早被克隆表達的蛋白，雖然只占蟲體總蛋白量的3%～5%，但其誘導機體產(chǎn)生的抗體量占總抗體量的50%，說明SAGl雖含量甚微，但為速殖子的主要抗原成分，是誘導宿主免疫應答的主要靶抗原。棒狀體蛋白（rhoptry protein，ROP）18定位于納蟲泡中［10］，是絲氨酸 蘇氨酸激酶，是重要的毒力因子［11］。R0P18可改變其感染的宿主細胞的信號傳導，使感染細胞的基因表達發(fā)生變化，阻止宿主細胞發(fā)生凋亡。當弓形蟲進入宿主細胞時，會生成一層保護膜將自身包裹起來，R0P18的作用則是讓宿主細胞的某些蛋白失效而無法破壞這層保護膜［12］。本研究旨在構建真核表達重組質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18，為弓形蟲DNA疫苗研制提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲株、質(zhì)粒及菌株

弓形蟲RH株速殖子、大腸埃希菌（E.coli）DH5α為本實驗室保存，pTG19-T載體購至上海捷瑞生物技術有限公司，p3×FLAG-Myc-CMVTM-24真核表達載體由江蘇大學醫(yī)學院龔愛華副教授惠贈。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶、第1鏈cDNA合成試劑盒（美國Thermo公司），T4DNA連接酶Ver.2.0購于寶生物工程（大連）有限公司，PCR預混液（美國Promega公司），DNA提取純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于上海捷瑞生物技術有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購于賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司，胎牛血清和新生牛血清購于杭州四季青公司，基因轉染試劑Ronfect購于上海榮柏生物科技有限公司，SAG1和ROP18［13］多克隆抗體由本實驗室制備。CO2培養(yǎng)箱（Forma seriesⅡ，美國Thermo公司），電泳儀（美國Bio Rad公司），冷凍型離心機（德國Eppendorf公司）。

1.3 蟲體的培養(yǎng)及DNA的提取

參考沈進等［14］方法在HeLa細胞中傳代培養(yǎng)弓形蟲RH株速殖子。用含10%新生牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HeLa細胞，待細胞密度為70%～80%時，更換含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液并感染蟲體，待蟲體漲破細胞后，收集蟲體。參照捷瑞公司基因組DNA純化試劑盒說明書提取弓形蟲速殖子基因組DNA，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SAG1及ROP18基因的體外擴增和克隆

根據(jù)數(shù)據(jù)庫ToxoDB弓形蟲基因組中SAG1和ROP18基因序列設計引物。SAG1上游引物P1：5′-CCCAAGCTTATGTCGGTTTCGCTGCACC-3′，下游引物P2：5′-CGGAATTCGCCGCGACACAAGCTGCGAT A-3′。SAG1 PCR反應條件：94℃預變性10 s；94℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25個循環(huán)；72℃延伸7 min。ROP18上游引物P1：5′-GGCAAGCTTATGTTTTCGGTACAGCGGCCACCTCTTA-3′，下游引物P2：5′-GGCGGATCCGCTTCTGTGTGGAGATGTTCCTGCTGTTC-3′。ROP18 PCR反應條件：95℃預變性10 s；94℃變性5 s，60℃退火90 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并切膠回收后與pTG19-T載體于16℃連接過夜。轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，氨芐西林篩選，陽性克隆接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。抽提質(zhì)粒，PCR、酶切鑒定，陽性克隆送上海尼桑生物科技有限公司測序。

1.5 SAG1及ROP18真核表達載體的構建

分別擴增陽性克隆菌株和含p3×FLAG-Myc-CMVTM-24的菌株，堿裂解法抽提并純化質(zhì)粒。SAG1和表達載體p3×FLAG-Myc-CMVTM-24分別用Hin dⅢ和Eco RⅠ進行雙酶切，ROP18和表達載體p3×FLAG-Myc-CMVTM-24分別用Bam HⅠ和Hin dⅢ進行雙酶切。1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切后的目的片段和載體并回收，將酶切后的載體和目的片段進行連接，轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞。抽提質(zhì)粒DNA，用PCR和雙酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒。

1.6 重組質(zhì)粒轉染人腎上皮細胞系293-T細胞

采用貼壁細胞的DNA轉染法，按非脂質(zhì)陽離子聚合物RonfectTMDNA轉染試劑使用說明進行。于轉染前1 d，將293-T細胞接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度為60%～80%且狀態(tài)良好時進行轉染。在轉染前2 h，吸除細胞原有的培養(yǎng)液，換為新鮮的含15%胎牛血清的DMEM。將2μg質(zhì)粒DNA用100μL無血清DMEM稀釋，充分混勻后制成DNA稀釋液。向DNA稀釋液中加入2μL RonfectTM，輕輕混勻，室溫靜置15～30min后，將轉染復合物加入細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻。置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細胞，于-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r轉染空質(zhì)粒p3× FLAG-Myc-CMVTM-24作為陰性對照。

1.7 SAG1、ROP18的體外表達分析

1.7.1 RT-PCR分析SAG1、ROP18的表達 按RNA抽提試劑盒的使用說明提取細胞總RNA，溶于DEPC處理水中。將RNA與oligo（dT）18置于65℃反應15 min后冰浴30 s，再加入反應緩沖液、RNA酶抑制劑、dNTP混合物和M-MLVRT，輕輕混勻后置于42℃反應60 min，70℃滅活5 min，反轉錄成cDNA，直接用于PCR分析，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7.2 蛋白質(zhì)印跡分析SAG1、ROP18的表達 收集轉染的293-T細胞，重懸于20μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液中，100℃水浴煮沸5 min，10 000×g離心5 min，取上清行SDS-PAGE電泳。先用80 V電泳15 min左右，待樣本被壓成一條直線后換成110 V。電泳結束后，取下凝膠，與PVDF膜緊貼，150 mA恒流電泳70min；轉印后的PVDF膜經(jīng)TBST洗滌后，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，室溫下作用30 min。將兔多克隆抗體用5%脫脂奶粉1∶10稀釋，于室溫孵育2 h，TBST洗滌3次；與1∶5 000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TBST洗滌3次；將膜置于化學發(fā)光儀下，滴加ECL顯色液觀察結果。

2 結果

2.1 真核表達載體p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1的鑒定

2.1.1 SAG1基因的擴增 PCR結果顯示，弓形蟲速殖子基因組DNA中擴增出SAG1的片段，其長度約1 011 bp，與預期結果一致（圖1）。進一步的測序結果表明，SAG1的基因序列與基因庫已發(fā)表的基因序列完全一致，開放閱讀框正確。

圖1 SAG1基因PCR擴增結果

2.1.2 真核表達載體p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1的鑒定 以構建成功的重組質(zhì)粒p3×FLAGMyc-CMVTM-24-SAG1為模板，特異性PCR引物擴增SAG1，成功擴增出目的片段，與預期結果相符（圖2）。該質(zhì)粒經(jīng)Hin dⅢ和Eco RⅠ雙酶切后得到與預期相同的兩條條帶，與理論數(shù)值完全符合（圖3）。

圖2 重組質(zhì)粒p3×FLAG-M yc-CMVTM-24-SAG1 PCR擴增結果

圖3 重組質(zhì)粒p3×FLAG-M yc-CMVTM-24-SAG1雙酶切電泳結果

2.1.3 p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1體外表達分析 分別用轉染有p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1、p3×FLAG-Myc-CMVTM-24空質(zhì)粒的293-T細胞提取的總RNA為模板行RT-PCR擴增，結果轉染有p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1的細胞擴增出約1 011 bp左右的條帶，與SAG1基因片段長度相符（圖4）。

蛋白質(zhì)印跡結果顯示，只有p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1轉染的293-T細胞有特異性條帶，表明轉染p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1的293-T細胞表達了SAG1（圖5）。

圖4 RT-PCR鑒定轉染細胞SAG1的表達

圖5 蛋白質(zhì)印跡鑒定轉染細胞SAG1的表達

2.2 真核表達質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18的鑒定

2.2.1 ROP18基因的擴增 從剛地弓形蟲基因組DNA中擴增ROP18的PCR結果見圖6。PCR擴增出ROP18的DNA片段長度約1 665 bp，與預期結果一致。進一步的測序結果表明，ROP18基因序列與基因庫已發(fā)表的基因序列完全一致，開放閱讀框正確。

圖6 ROP18基因PCR擴增結果

2.2.2 真核表達質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18的鑒定 以構建成功的重組質(zhì)粒p3× FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18為模板，特異性PCR引物擴增ROP18，成功擴增出目的片段，與預期結果相符（圖7）。真核表達質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18經(jīng)Hin dⅢ和Bam HⅠ雙酶切之后得到與預期相同的2條條帶（圖8）。

圖7 重組質(zhì)粒p3×FLAG-M yc-CMVTM-24-ROP18 PCR擴增結果

2.2.3 p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18體外表達分析 分別用轉染有p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24空質(zhì)粒的293-T細胞提取的總RNA作模板行RT-PCR擴增，只有轉染有p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18的細胞擴增出約1 665 bp左右的條帶，與ROP18基因片段長度相符（圖9）。

蛋白質(zhì)印跡結果表明，只有p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18轉染的293-T細胞有特異性條帶，表明轉染p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18的293-T細胞表達了ROP18（圖10）。

圖9 RT-PCR鑒定轉染細胞ROP18的表達

圖10 蛋白質(zhì)印跡鑒定轉染細胞ROP18的表達

3 討論

弓形蟲病疫苗研制經(jīng)歷了全蟲疫苗、蟲體特異組分疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗4個階段，其中核酸疫苗以其優(yōu)異性能成為當前弓形蟲疫苗研制的熱點。核酸疫苗是編碼免疫原或與免疫原相關的真核表達質(zhì)粒DNA（有時也可是RNA），其可經(jīng)一定的途徑進入動物體內(nèi)，經(jīng)宿主細胞攝取后，通過轉錄和翻譯表達出抗原蛋白，刺激機體產(chǎn)生非特異性和特異性兩種免疫應答反應，從而起到免疫保護作用。

速殖子是弓形蟲的主要致病階段，在侵入細胞的過程中，可溶性蛋白SAG1可以直接結合到宿主細胞表面。速殖子表膜是宿主細胞免疫防御識別和殺傷蟲體的主要作用部位。占國清等［15］用重組真核表達質(zhì)粒PBK-P30肌肉注射免疫BALB/c小鼠，誘導其產(chǎn)生了體液及細胞免疫應答。高世同等［16］用構建的pVAX1-SAG2免疫小鼠，誘導其產(chǎn)生了特異性的IgG抗體。ROPs對弓形蟲入侵宿主細胞起重要作用，目前已知有30多種ROPs蛋白，Chen等［17］用構建的ROP1基因重組質(zhì)粒免疫小鼠，誘導其產(chǎn)生了細胞免疫及體液免疫。Wang等［18］用構建的真核表達質(zhì)粒PVAX-ROP13制成DNA疫苗，用肌肉注射的方法免疫小鼠，小鼠特異性抗體IgG水平明顯升高，弓形蟲感染后小鼠的存活率顯著提高。上述研究結果表明，弓形蟲表面蛋白SAG、ROPs對于弓形蟲感染具有良好的免疫保護作用，是研制弓形蟲核酸疫苗有力的候選基因。

本研究采用的真核表達載體p3×FLAG-Myc-CMVTM-24含有人巨細胞病毒（CMV）高效啟動子/增強子序列，是能夠使外源基因在哺乳動物細胞內(nèi)高效表達的良好載體，常用于構建核酸疫苗。本研究用基因工程的方法，將弓形蟲SAG1、ROP18基因分別連接至真核表達載體，成功構建了真核表達質(zhì)粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAGMyc-CMVTM-24-ROP18，為弓形蟲核酸疫苗的研制奠定了基礎。

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Construction and in vitro expression of Toxoplasma gondii SAG1，ROP18 eukaryotic expression plasm ids

WU La-mei1，WU Ting1，WU Liang1，WANG Xiao1，SU Dan-hua1，LIU Yuan1，TAO Si-jia1，WEIYi-qing1，JIANG Xu-gan1，CHEN Sheng-xia1，CAO Jian-ping2
（1.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Shanghai200025，China）

Objective：To construct two recombinant eukaryotic expression plasmids containing the surface antigen（SAG）1 and rhoptry protein（ROP）18 gene of Toxoplasma gondii，and express SAG1 and ROP18 proteins in the eukaryotic system.Methods：The gene fragments encoding SAG1 and ROP18 were amplified by PCR with special primers from Toxoplasma gondii genomic DNA respectively，and were cloned into pTG19-T vector.The rightgene fragmentswere subcloned into p3×FLAG-Myc-CMVTM-24 vector to construct the eukaryotic expression plasmids p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1 and p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18.The recombinant plasmidswere transfected into human renal epithelial 293-T cell lines respectively，and the expression of SAG1 and ROP18 in transfected cellswere detected by RT-PCR and Western blotting.ResultsThe gene fragments encoding SAG1，ROP18 were 1 011 bp and 1 665 bp respectively，which were consistantwith the expected size.The analysis of enzyme digestion，PCR and sequencing showed that the recombinant eukaryotic expression plasmids p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1，p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18 were constructed correctly.RT-PCR and Western blotting analysis of cells transfected SAG1，ROP18 gene displayedpositive bands.Conclusion：Recombinant eukaryotic expression plasmids of SAG1，ROP18 have been successfully constructed，the recombinant plasmids can express SAG1，ROP18 proteins in a eukaryotic system.

Toxoplasma gondii；SAG1；ROP18；eukaryotic expression plasmid

R382.5 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0246-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140294

國家自然科學基金資助項目（81301453）；衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室開放課題（WSBKTKT201302）；中國博士后科學基金資助項目（2014M561598）；江蘇省博士后科研資助計劃項目（1402171C）；江蘇大學高級人才啟動基金資助項目（13JDG023，13JDG127）

吳臘梅（1989—），女，碩士研究生；陳盛霞（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：chensxia@ujs.edu.cn

2014-11-17 ［編輯］ 劉星星