基于情緒應激下心血管疾病大鼠復合模型的構建探索益氣活血方對脂聯素水平的影響*

萬 婷，郭書文，吳佳妮，張 璐，武建功，陳 曦，劉文臣，蘇兆鐸

（北京中醫藥大學，北京100029）

隨著現代都市人們生活方式，生活狀態的改變，各方面壓力的增加以及環境的污染，心血管疾病已然成為威脅現代社會人類健康的主要疾病之一。在跟隨導師門診過程中，發現心血管疾病收錄近2 年明顯相對增多，并且呈年輕化趨勢，情緒主訴增多明顯。有相當一部分患者，在心血管疾病癥狀臨床相關指標改變的基礎上，描述有內心的壓抑、恐懼、焦躁、易怒以及失眠等情緒改變。心血管疾病和神經內分泌系統聯系緊密，情緒和心血管疾病的關系在現代醫學界也越來越多的促進了心血管、抑郁癥臨床治療方案的調整[1]。本實驗就是立足于這樣的現實狀況，通過對導師益氣活血中藥臨床療效以及相關中醫理論的研究進行了設計，以期進一步揭示益氣活血藥的作用機制，以及心腦、心血管疾病以及情緒的相關作用機制，為臨床用藥，組方以及后續相關實驗研究做出一定的探索。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級的8 周齡健康雄性SD（Sprague-Daw－Ley）大鼠，體質量（200±10）g，由維通利華實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。飼養于北京東直門醫院動物實驗室，除情緒造模刺激需要外，整個實驗均常規飼養，室溫：21～23℃，照明節律。

1.2 藥品

1.2.1 造模用藥

鹽酸異丙腎上腺素注射液，由上海禾豐制藥有限公司提供，批準文號：國藥準字：H31021344，批號：131103，規格：2mL∶1mg。

1.2.2 治療用藥

中藥組：取人參、生黃芪、川芎、當歸、三七制成顆粒劑（由北京中醫藥東直門醫院藥房提供，溶于燒開的蒸餾水中，配比組方用量比例為導師多年臨床總結經驗，服藥量為：1 次/d，21g/（kg·d）（前期研究確立）[2]。

西藥組，陽性對照用藥：培哚普利（雅施達），由天津施維雅制藥有限公司提供，批準文號：國藥準字：H20034053，批號：2004788，規格：4mg×30 片/盒。服藥量為：1 次/d，劑量為0.4mg/（kg·d）（臨床等效劑量），將藥物溶于蒸餾水中，調整藥物濃度達到10mL/（kg·d）的用藥容積。

1.3 實驗儀器與實驗試劑

1.3.1 實驗儀器

JAll0003 電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；Vev770 超聲檢測儀（加拿大visualsonics 公司）；突光定量PCR 儀：Thermo，美國；突光PCR 板：Thermo，美國；恒溫水浴箱：J-MAX，中國；旋禍混合器：其林貝爾，中國；電泳儀：北京六一，中國；水平瓊脂糖電泳槽：北京六一，中國；-8℃冰箱：中科美菱，中國；電動玻璃勻漿器：新芝，中國；搖床：其林貝爾，中國；臺式冷凍離心機：eppendorf，德國。

1.3.2 手術器械及其他物品

眼科剪、眼科鑷，直剪刀4 把，鑷子4 把，大剪子1 把，剝離鉗1 把（180～200℃，烘烤4～6h）。

1.3.3 實驗試劑與溶液配方

瓊脂糖：西班牙，逆轉錄試劑盒：Fermentas，EDTA，Sigma；Tris；Sigma；Trizol；Invitrogen，Taq 醇：Genstar，引物：上海生工，DEPC：Sigma，DL2000 DNA Marker：Genstar，dNTP：Genstar，E.B：Sigma，SYBGREEN PCR Mix；冷生理鹽水（氯化鈉注射液），由國藥集團化學試劑有限公司提供，批號：國藥準字H11021192；70%酒精（醫用乙醇），由新鄉市三偉消毒制劑有限公司提供，批號：20141005；水合氯醛（水合三氯乙醛），由國藥集團化學試劑有限公司提供，批號：20140619。

2 方法

2.1 造模方法

動物在適應性飼養后，進行腹腔注射異丙腎上腺素[5mg/（kg·d）]3 d，制造心肌缺血、心力衰竭衰模型[3]。注射后觀察48h，穩定后，對所有造模動物進行心率、心跳強度的觀察和記錄，根據心率結合隨機數字表進行隨機分組，分組情況如表1。

在心血管疾病造模基礎上，模仿現代人壓力、孤獨、欲求不滿等狀態，連續30 d，灌服藥物的同時，對藥物組以及復合模型組大鼠進行情志干擾[4-5]，制造復合模型。空白組和ISO 模型組常規飼養，不進行情緒刺激。造模過程中西藥組和ISO 模型組分別死亡2 只。

2.2 實驗分組

表1 實驗分組

稱量動物體質量，標記。

2.3 給藥方法

中藥、西藥藥物組每天上午，按量（2mL/200g·d-1）按時分組灌服益氣活血中藥、西藥陽性對照藥。空白組和模型兩組動物灌服等量蒸餾水。后期根據大鼠重量的增加，監測體質量，不斷進行劑量的調整。灌胃過程中可能由于人為操作不當，中藥組死亡1 只。

2.3 檢測指標及檢測方法

2.3.1 超聲檢查

給藥造模情緒干擾32d 后，對所有大鼠行超聲檢查，麻醉大鼠后，仰臥位固定，涂抹膏狀綠色透明藥物導體，采用高頻探頭RMV716 對大鼠心臟進行定位，在二尖位，水平部進行探測，取胸骨旁短軸切面，由二維超聲引導M 型曲線進行測定，每組原始數據取連續3 個心動周期測量的平均值，記錄保留3 次數值，本實驗根據實驗動物造模類型和實驗目的，主要對短軸縮短率（FS）、射血分數（EF）指標進行了超聲檢測，作為心血管疾病成模標準[6]。

2.3.2 曠場實驗行為學觀察

于情緒干擾前，干擾14d，干擾32d 3 個時間點，對大鼠進行行為學觀察。將大鼠放置于75×75×50cm，四周為黑色，底部呈白色，且被劃分為25 格的箱子中央。整個實驗在安靜通風昏暗室內進行，為防止干擾，實驗開始前讓大鼠提前進行環境的熟悉，整個實驗過程中減少人員干擾。觀察記錄大鼠縱向，橫向行動，每只3min，間隔清理排泄物，并且用酒精消毒，防止不同大鼠氣味的誘導。橫向運動計數標準：三只足進入一格記錄為橫向運動一次；縱向運動記錄標準：攀爬一次記錄為縱向運動一次[7]。

2.3.3 RT-PCR（脂聯素檢測）

引物設計：脂聯素以及內參Rat-Actin PCR 的引物序列（由生工生物工程有限公司合成），見表2。

表2 脂聯素以及內參Rat-Actin PCR 的引物序列

PCR 免疫印跡分析，從100mg 心肌和海馬體組織中提取總蛋白質（從心尖上剪取心肌組織），分析其濃度。填充于12%的聚丙稀酰胺，進行凝膠電泳。用公司提供的Rat-Actin 作為內標標準化，同時進行檢測。通過溶解曲線分析，實驗各組結果均為單一峰，說明PCR 擴增特異性較好，樣本3 次重復實驗數據的重復性較好。結果使用ΔΔCt 法進行數據分析整理后得到如表5。

2.4 統計學處理

全部數據經過記錄和歸類整理編號區分，用Excel 和SPSS17.0 統計軟件進行分析處理，數據結果均用均數±標準差（x±s）表示，對單變量計量資料樣本均數間進行比較，若符合正態分布，用單因素方差進行處理（One-Way ANOVA）。多重比較，用LSD 或者SNK 法。若方差不齊，則用Games-Howe II 進行分析，雙側檢驗，檢驗水準為P＜0.05。

3 結果

3.1 超聲心動圖結果

表3 超聲心動圖各組結果對比（x±s，%）

各組對比，第32 天超聲心動圖測試，有一定的差異性：2 個模型組較空白組射血分數（EF）和短軸縮短率（FS）明顯縮小，有顯著統計學差異（P＜0.01），中藥組、西藥組較模型兩組左室射血分數（EF）和短軸縮短率（FS）有所增加，有顯著統計學差異（P＜0.01或P＜0.05）。見表3。

3.2 曠場實驗結果

通過數據分析：空白組前后差異不大，ISO 模型組前后對比無統計學意義，復合模型組服藥后32d 橫向與情志造模前橫向對比有統計學意義（P＜0.01）；中藥組服藥后32d 橫向與情志造模前橫向對比有統計學意義（P＜0.01）；西藥組服藥后32d 橫向與情志造模前橫向對比有統計學意義（P＜0.01），說明情緒刺激還是起到一定作用。見表4。

表4 造模前，第14，30 天曠場實驗平均值（x±s）對比（單位：次）

3.3 脂聯素的檢測結果

心肌組織和腦海馬體中均在基因水平檢測出脂聯素，將心肌組織和腦組織所含脂聯素基因層面結果進行各組含量的對比：在腦海馬體中，與空白組相比，兩個模型組脂聯素水平均顯著降低（P＜0.05），空白組、ISO 模型組同復合模型組3 組的對比，復合模型組較ISO 模型組脂聯素水平有降低的趨勢（P=0.056），兩者在基因層面含量上都低于空白組，說明情緒應激、心血管疾病均可能對腦海馬體中的脂聯素水平造成一定的影響，引起脂聯素水平的降低。同樣在心肌組織中，也得出如上結論。如上表所示：益氣活血藥治療組具備扭轉mRNA 水平的作用，相對于復合模型組提升了心肌組織和腦海馬體中脂聯素的含量，有統計學意義（P＜0.05）；西藥組在對脂聯素含量的影響上僅僅起到提升的趨勢（P=0.062），可能由于藥物作用時間等各方面因素，在基因層面作用效果不甚顯著，存在繼續實驗研究探索的價值。見表5。

表5 脂聯素不同組之間，不同臟器部位的含量對比（x±s）

4 討論

脂聯素是由脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性多肽，其在機體中可以對脂類和糖類的代謝產生影響[8]。在心血管疾病和情緒應激的關聯性中起著很大的作用，情緒可能影響體內脂聯素的含量，所謂的心寬體胖和心情不佳時食欲降低和心情不好想吃東西，抑郁癥的人容易消瘦等等這些生活現象與脂肪細胞密切相關，與情緒、脂聯素水平也密切相關，脂聯素這一含量的變化對心血管疾病有重要的影響，情緒和心血管疾病通過脂聯素相關聯，是心血管疾病的雙心醫學基礎依據之一[9]。通過對比藥物組和空白組、復合模型組的含量，得出益氣活血中藥在提升脂聯素上有很重要的作用。腦海馬體和心肌組織中都存在脂聯素的表達，說明兩者自身均產生脂聯素，兩者的協調和關聯性，需要進一步的實驗數據去驗證。最近有相關研究發現，血漿脂聯素水平在社會挫敗壓力應激模型中是降低的，小鼠腦室內注射外源性脂聯素后，血漿脂聯素水平產生變化，那么作為在擔負著記憶、空間定位功能承載者的海馬體[10]，其中脂聯素含量的變化在情緒應激刺激下基因層面含量的變化同心肌組織間是分開還相互影響的，就有待于在時間點上，進一步進行實驗研究。心肌中脂聯素mRNA 降低可能是由腦海馬體、血清脂聯素下調引起的。然而，低血清濃度最終決定了轉運到心肌的脂聯素水平偏低。值得注意的是，無論是心肌還是海馬，在益氣活血藥物的干預下，脂聯素水平都逐漸在提升接近正常的水平，這可能就是益氣活血藥物在治療心血管疾病的同時，具有調整患者情緒，從整體將疾病導向良性循環的部分原因。

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