普洱茶茶氨酸的含量測定及其抗氧化活性的研究

肖作為，鄭楠楠，陸廣琴，張智敏，黃建華*（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

普洱茶茶氨酸的含量測定及其抗氧化活性的研究

肖作為，鄭楠楠，陸廣琴，張智敏，黃建華*
（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的研究普洱茶中茶氨酸的含量及其抗氧化活性。方法采用高效液相色譜方法對普洱茶中茶氨酸含量進行測定，分析條件為：Aglient TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：(A)0.1%磷酸水溶液(B)甲醇；流速：1.000 0 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：25℃；檢測波長：203 nm。對分析條件進行優化和驗證，構建了茶氨酸含量精確分析方法，進而通過清除1，1-二苯基-2-苦基肼基自由基（DPPH）法來測定其抗氧化活性。結果：30個普洱茶氨酸含量范圍為7.350 1～14.235 3 mg/g，平均值為9.638 3 mg/g，抗氧化性在29.06%～72.28%之間。結論高效液相色譜法能夠準確測定普洱茶中茶氨酸含量，對普洱茶抗氧化活性研究有利于對普洱茶保健療效的進一步鑒定和提高。

高效液相色譜法；茶氨酸；1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基；抗氧化性

普洱茶是以中國云南特有的大葉種曬青茶(Camellia sinensis var.assamica)為原料經過特殊發酵工藝制成的黑茶[1]。不同的發酵程度對茶的化學活性成分有一定的影響，相比綠茶、烏龍茶、紅茶在加工過程中分別進行未發酵、部分發酵、全發酵來說，普洱茶屬于后發酵產物。普洱茶在人工“渥堆”過程中經歷了微生物的酶促作用以及濕熱作用，加之后發酵技術塑造了其具獨特的色、香、味全品質特征。茶葉中含有的活性物質如茶多酚、茶多糖、生物堿、微量元素等成分，具有降血脂、降血糖、抗衰老、美容減肥以及神經保護功能等功效[2-3]。

普洱茶作為茶類保健飲品，特殊的后發酵工藝使其在活性成分含量和藥理作用方面與其他茶類相比有顯著的不同。栗志文等[4]通過整體動物模型研究比較普洱茶提取物與綠茶提取物的降糖功效，結果表明普洱茶提取物的降糖功效優于綠茶提取物。研究表明，茶葉中的氨基酸不僅具有緩解精神壓力、抗運動疲勞、抑制肝損傷、抗癌等功效，同時能夠促進大腦和神經的生長，預防帕金森氏癥、老年癡呆癥及傳導性神經功能紊亂等疾病[5-7]。氨基酸是構成茶葉的重要組成部分，其含量一般為干重的1%～4%。茶葉中氨基酸的種類甚多，目前經常研究的有26種。其中以茶氨酸的含量最高，通常茶氨酸要占氨基酸的50%以上。茶氨酸是茶葉中特有的一種非蛋白氨基酸，可以緩減苦澀，增強茶湯香甜味，對茶滋味具有重要作用[8]。本文利用高效液相色譜法測定了普洱茶中的茶氨酸含量并進一步測定其抗氧化活性，實驗結果證明提出的方法能夠準確測定普洱茶的茶氨酸含量及抗氧化活性，為普洱茶的開發和利用提供了依據。

1 實驗材料

全波長酶標儀購買自Thermo Fisher Scientific公司；30個普洱茶樣品取自云南省普洱市，茶葉經過粉碎、過篩、置于自封袋，然后在避光、干燥、室溫的條件下保存；DPPH試劑購自Sigma公司。

2 方法

2.1 茶氨酸含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Aglient TC-C18(4.6× 250 mm,5 μm）柱；流動相：(A)0.1%磷酸水溶液(B)甲醇；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：25℃；檢測波長：203 nm。

2.1.2 樣品預處理 將30個普洱茶樣本用粉碎機粉碎，過60目篩，于60℃烘箱中烘干4 h，用密封袋密封、避光、干燥，于室溫條件下保存。其中甲醇為色譜純試劑、磷酸分別為分析純試劑。茶氨酸的標準品購自中國食品藥品檢定研究院。

2.1.3 對照品的制備 準確稱取6.000 0 mg茶氨酸標準品，溶解在二次蒸餾水中，定容到1 mL容量瓶中，配成6 mg/mL的標準溶液，依次稀釋得到0.05、0.10、0.20、0.40、1.00、2.00 mg/mL梯度濃度，于4℃下保存備用。

2.1.4 供試液的制備 稱取樣品1.000 0 g于錐形瓶中，按照物料比1:50加入50 mL二次蒸餾水，超聲提取[9]。超聲溫度控制為60℃，超聲時間為30 min，超聲完成后冷卻靜置、過濾，再取上清液過0.45 μm的膜，濾液于4℃下保存，以備分析測試。2.1.5 高效液相梯度 溶劑條件按照表1中梯度進行。

表1 HPLC梯度洗脫

2.2 清除DPPH活性的測定

2.2.1 樣品的提取方法 根據參考文獻[10]進行優化，采用超聲提取的方法，使用70%的乙醇，料液比為1：25，超聲時間為40 min，超聲溫度為70℃，超聲完成后，抽濾取其上清液，定容到50 mL的容量瓶中。

配置2.5 mmol/mL的Trolox標準溶液，作為對照品溶液。將其稀釋至不同的濃度，使得Trolox的線性在 58.593 8、49.019 6、39.370 1、29.644 3、19.841 3、9.960 2 μmol/mL范圍內。

取5 μL的樣品溶液和空白(甲醇溶液)加入到96孔板中，每個樣本做2個平行樣，然后加入等量的DPPH甲醇溶液，避光，室溫下反應30 min后，在515 nm下測量吸光度。

按照下列公式計算抑制率：

S:清除率，A:空白樣品的吸光值，B:待測液的吸光值。

3 結果與討論

3.1 普洱茶氨基酸樣品測定

采用上述方法對普洱茶中的茶氨酸進行分析測定，根據茶氨酸標準品的色譜峰確定茶氨酸的保留時間(t=5.27 s)，不斷優化色譜條件，使樣本中茶氨酸可以與周圍的物質實現較好的分類，所得到的標準品和樣本的色譜峰圖如圖1所示。根據茶氨酸標準曲線代入茶氨酸的峰面積可計算出樣本中茶氨酸的含量。

圖1 標準品和樣品的茶氨酸色譜峰

3.2 分析方法學驗證

3.2.1 線性關系考察 分別精密吸取2.1.3制備的對照品溶液5 μL注入液相色譜儀中，測定其峰面積積分值。得到的標準曲線如圖2所示，回歸曲線的R2大于0.999，表明線性關系良好。

以回歸曲線濃度 (mg/mL)為橫坐標，峰面積(mAU*s)為縱坐標繪制茶氨酸的標準曲線圖，LOD 和LOQ分別為S/N=3和S/N=10時標準品的濃度，通過計算可得到 LOD=9.343 75 μg/mL，LOQ= 31.145 80 μg/mL。

3.2.2 精密度、重復性、穩定性和回收率的考察

取一份對照品溶液，連續進樣6次，進行儀器的精密度考察；制備6份同一份樣本，進行重復性考察；取一份供試液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，進行穩定性考察；取6份同一樣本按照2.3.3所示進行回收率考察。計算得到峰面積的相對標準偏差分別為1.16%、1.71%、0.40%和2.31%，數值均小于3%，說明儀器精密度、方法重復性、供試液穩定性良好。

圖2 茶氨酸的標準曲線圖

3.2.3 樣品含量測定 按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，并采用構建的方法對30個普洱茶進行分析測定。精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定茶氨酸的含量。根據茶氨酸標準品的HPLC圖確定茶氨酸的保留時間，并由外標法定量出茶葉中茶氨酸的含量。最終HPLC所測得的30個普洱茶樣本的茶氨酸含量平均值為9.638 3 mg/g，得到的分析結果見表2。

表2 普洱茶茶氨酸含量及抗氧化性

3.3 樣品抗氧化測試

利用2.2中提出的方法抗氧化性對30個普洱茶的抗氧化性進行測試得到的抗氧化性結果列于表2。

4 結論

作為茶類保健飲品，普洱茶具有延緩衰老、預防癌癥、增強機體免疫力、改善動脈粥樣硬化及美容等功效。其獨特的保健功能與普洱茶經過特殊后發酵過程中有效化學成分發生變化是息息相關的。因此，對道地茶葉進行活性成分含量測定，并對其抗氧化性進行測定，將有利于對高品質、有益健康的普洱茶的開發和應用。

[1]陳 保，劉新月，蒲泓君，等.不同普洱茶原料渥堆發酵過程中主要化學成分的變化研究 [J].食品安全質量檢測學報，2015，6 （4）：1 279-1 286.

[2]黃春桃，杜萬紅.茶葉的藥理作用研究新進展 [J].中南藥學，2010，8（9）：692-695.

[3]羅 堃，何 群，葛云鵬，等.Folin-Ciocalten比色法測定安化黑茶中茶多酚的含量[J].湖南中醫藥大學學報，2013，33（5）：65-66，74.

[4]栗志文，王媛媛，王根輩，等.普洱茶提取物與綠茶提取物降糖功效的研究[J].茶葉科學，2014，34（5）：428-434

[5]高小紅，袁 華.茶氨酸的研究進展[J].化學與生物工程，2004，21 （1）：7-9.

[6]白寶豐.茶氨酸抗運動性疲勞機制及應用前景的思考[M].中國實驗方劑學雜志，2011，17（12）：279-282.

[7]王海燕，張新卿.茶的神經保護作用 [M].中華老年醫學雜志，2006，25（12）：942-945.

[8]Juneja LR,Chu DC,Okubo T,et al.L-theanine—a unique amino acid of green tea and its relaxation effect in humans[J]. Trends in Food Science and Technology,1999,10(6):199-204.

[9]Vuong QV,Stathopoulos CE,Golding JB,et al.Optimum conditions for the water extraction of L-theanine from green tea[J]. Journal of separation science,2011,34(18):2 468-2 474.

[10]楊海濤.超聲輔助提取棕櫚葉中總黃酮的工藝研究[J].安徽農業科學,2011,39(28):17 558-17 558.

（本文編輯 匡靜之）

The Research of the Content of L-Theanine in Pu-erh Tea and its Antioxidant Activity

XIAO Zuowei,ZHENG Nannan,LU Guangqin,ZHANG Zhimin,HUANG Jianhua*
(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo study the contents of L-Theanine in Pu-erh teas and its antioxidant activity.MethodsThe content of L-Theanine was determined by HPLC which performed on an Agligent TC-C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm)with a mobile phase of 0.1%phosphoric and methanol at a flow rate of 1.0 mL/min,a column temprature of 25℃,and a detection wavelength of 203nm,and weighing the antioxidant activity of the Pu-erh tea by 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH).ResultsThe content of L-Theanine in 30 batces of Pu-erh tea was 7.350 1-14.235 3 mg/g,and the average value was 9.638 3 mg/g. The antioxidant activity was between 29.06%-72.28%.ConclusionThe content of L-Theanine was determined accurately by HPLC.The antioxidant activity of Pu-erh tea will promote the dentify and enhance of its health care effect.

high performance liquid chromatography;L-Theanine;1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl;antioxidant activity

TS272，R284

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.12.013

2015－11-25

肖作為，男，碩士，講師，主要從事中藥保健食品研發、營養與保健研究等工作。

*黃建華，男，博士，講師，E-mail:huanjianhua1995@163.com。