吸煙對男性精液質量、精子DNA 完整性及Chk1基因表達的影響

李強，崔向榮，井宣，王振強，義建偉，武學清＊

（1.山西省婦幼保健院生殖醫學中心，太原 030000；2.山西省人民醫院檢驗科，太原 030000；3.太原市中心醫院輔助生殖醫學中心，太原 030000）

精子DNA 損傷會降低精子受精能力和胚胎發育潛能，從而降低妊娠率，同時還會使流產率增高。據文獻報道［1］，吸煙不僅可引發男性精子濃度及活力的降低，還可導致精液中活性氧（ROS）水平的顯著升高，進而產生氧化應激，引起精子細胞膜的改變，甚至引發精子DNA 的損傷。研究發現［2］，細胞周期檢測點激酶1（Chk1）表達的下降可引發細胞損傷后修復功能的缺失，進而導致DNA 損傷檢測點失去作用。然而吸煙患者精液質量下降及精子DNA 損傷增加是否與Chk1的下調相關，目前尚無報道。本研究通過測定吸煙者與不吸煙者的Chk1基因表達差異，探討吸煙對男性精液質量的影響與DNA 完整性及損傷后修復相關基因Chk1 表達的相關性。

資料與方法

一、研究對象與分組

選擇2014年2月至2015年2月于山西省婦幼保健院生殖醫學中心就診的男性患者1 128例為研究對象，平均年齡（34.18±3.79）歲，其中吸煙組841例，不吸煙組287例。無外傷及遺傳性疾病家族史，性功能正常，體檢無明顯睪丸、附睪及輸精管異常，無感染及其它全身性疾病。除外生活或工作環境有污染、酗酒、精索靜脈曲張及無精子癥的患者。

根據世界衛生組織對吸煙情況的標準化建議，將研究對象分為不吸煙組（從未吸煙男性）和吸煙組（經常吸煙者：每天吸煙1支以上，且連續或累計吸煙6個月以上）。依據每天吸煙支數，將吸煙組患者劃分為：輕度吸煙組（230例）：日吸煙量≤9支，中度吸煙組（345例）：日吸煙量10～≤19支，重度吸煙組（266例）：日吸煙量≥20支；同時依據吸煙年限將吸煙組患者劃分為：短煙齡組（238例）：吸煙年限≤5年，中煙齡組（269例）：吸煙年限5～10年，長煙齡組（334例）：吸煙年限≥10年［3］。同時對患者一般情況（年齡、職業、煙、酒習慣）進行詳細詢問。研究對象均取得本人同意且簽署知情同意書，并由醫院倫理委員會討論通過。

二、研究方法

1.精液標本收集：研究對象行精液檢查前禁欲2～7d，手淫法取精，裝入無菌、干燥、清潔、無毒取精杯中，用去皮稱重法計算精液量，置37℃水浴鍋內液化，經30～60min液化后，肉眼觀察精液顏色、粘稠度，用pH 試紙檢測pH 值，采用西班牙SCA全自動精液質量分析系統進行精液參數分析。另分別取1ml進行精漿鋅、頂體酶和精子DNA 完整性檢測。

2.精液常規分析：采用西班牙SCA 全自動精液質量分析系統，按照《WHO 人類精液檢查與處理實驗室手冊》（2011年，第5版）標準，對吸煙組與不吸煙組進行精液濃度、精子活率、活力進行檢測，同時采用改良巴氏染色法對患者精液進行形態學檢測。

3.吖啶橙染色法檢測精子DNA 完整性：按照精子核染色試劑盒（深圳華康生物醫學工程）的檢測方法，對DNA 完整性進行檢測。步驟簡述如下：待精液液化后，取1.0ml精液離心10min（1 000g）去除精漿。加入1 ml洗滌液，混勻后離心5 min（1 000g），去上清。洗滌兩次后，棄上清，調整精子濃度為50×106／ml。取懸浮液涂片，晾干，固定10min。吖啶橙工作液染色5 min后，于熒光顯微鏡高倍鏡下觀察。計數200條精子，其中綠色代表DNA 雙鏈精子，紅色代表DNA 單鏈精子，橙黃色代表DNA 雙鏈不穩定鑿開精子。計算雙鏈DNA精子百分率。

4.精子Chk1基因mRNA 相對表達量的檢測：取精液標本于13 000r／min條件下離心15min，去上清，隨后PBS洗滌3次，置于1ml Trizol提取液中，提取精子總RNA，逆轉錄為cDNA 后于-80℃冰箱中儲存備用。采用實時熒光定量PCR（RT-QPCR）法，對逆轉錄的cDNA 濃度進行PCR擴增。以β-actin作為內參，并優化反應條件，使目的基因與內參的擴增效率近似相等且接近100%，Ct值代表基因的起始拷貝數，可根據Ct值比較基因的表達量。ΔΔCt＝（Ct目的基因Ct內參基因）（Ct陰性對照Ct內參基因），以2-ΔΔCt計算各組mRNA的相對表達量。基因引物序列如下：Chk1上游引物：5TGAAGCCGGCCGTAGACT3，下游引物：5TCCACAGGACCAAACATC3；β-actin上游引物：5TGTACGTTGCTATCCAGGCT3，下游引物：5CTCCTTAATGTCACGCACGA3，所有引物均由上海Invitrogen生物工程有限公司合成。

三、統計學分析

本數據資料運用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料用±s表示，兩組間均數比較，采用t檢驗和秩和檢驗；率的比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman，結果用相關系數r 表示相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般情況比較

本研究中不吸煙組共287 例，平均年齡為（34.32±3.43）歲，吸煙組841例，平均年齡為（33.98±3.99）歲，兩組年齡無統計學差異（P＞0.05），可排除年齡對相關指標的影響。

二、不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精液常規參數比較

吸煙組與不吸煙組及日吸煙量各組相比，精液量、精液濃度及精子總數均無顯著差異（P＞0.05）；吸煙組的前向運動精子率較不吸煙組顯著下降（P＜0.05），其中輕度吸煙組與不吸煙組相比，前向運動精子率無顯著差異（P＞0.05），中度及重度吸煙組與不吸煙組相比，前向運動精子率顯著降低（P＜0.05）（表1）。

三、不吸煙組與不同吸煙年限組間精液常規參數的比較

長煙齡組精液量、濃度、總數及前向運動精子率低于不吸煙組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。短煙齡組與不吸煙組相比，各精液常規檢測項目無統計學差異（P＞0.05）。中煙齡組較不吸煙組，前向運動精子率顯著下降，差異具有統計學意義（P＜0.05），其余各項與不吸煙組相比，無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

四、不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精子形態學比較

經巴氏染色后，于顯微鏡下計數200條精子，計算各組正常精子率及頭、體、尾各段異常精子率。其中不吸煙組的正常精子率及各段異常精子率與總吸煙組及輕、中度吸煙組相比無顯著性差異（P ＞0.05），而重度吸煙組的頭部精子缺陷率顯著高于不吸煙組（P＜0.05）（表3）。

表1 不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精液常規參數比較（±s）

表1 不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精液常規參數比較（±s）

注：與不吸煙組比較，＊P＜0.05

組 別 例數 精液量（ml） 精液濃度（×106／ml） 精子總數（×106） 前向運動精子率（%）不吸煙組 287 3.62±1.38 45.37±26.83 49.29±30.29 26.97±11.66吸煙組 841 3.45±1.17 41.47±22.94 45.62±32.94 18.16±10.48＊ 輕度吸煙組 230 3.52±1.08 44.39±23.42 47.27±29.95 26.52±11.63 中度吸煙組 345 3.39±1.21 42.61±28.26 45.74±31.44 19.48±10.24＊ 重度吸煙組 266 3.46±1.33 40.03±26.73 43.28±30.61 15.29±9.27＊

表2 不吸煙組與不同吸煙年限組間精液常規參數的比較（±s）

表2 不吸煙組與不同吸煙年限組間精液常規參數的比較（±s）

注：與不吸煙組比較，＊P＜0.05

組 別 例數 精液量（ml） 精液濃度（×106／ml） 精子總數（×106） 前向運動精子率（%）不吸煙組 287 3.62±1.38 45.37±26.83 49.29±30.29 26.97±11.66短煙齡組 238 3.58±1.14 43.55±21.39 48.37±22.56 25.69±10.18中煙齡組 269 3.42±1.62 41.69±24.11 44.74±21.39 18.79±11.24＊長煙齡組 334 2.19±1.03＊ 28.95±23.22＊ 38.67±18.22＊ 13.29±10.43＊

表3 不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精子形態學比較（±s）

表3 不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精子形態學比較（±s）

注：與不吸煙組比較，＊P＜0.05

組 別 例數 正常形態精子（%） 頭部缺陷精子（%） 中段缺陷精子（%） 尾部缺陷精子（%）不吸煙組 287 7.21±1.48 82.50±10.66 41.28±9.58 6.13±7.49吸煙組 841 6.53±1.33 88.32±15.21 49.22±14.23 10.64±11.77 輕度吸煙組 230 7.11±1.28 85.36±12.10 47.63±12.33 9.37±8.63 中度吸煙組 345 6.98±1.55 86.01±10.26 46.51±14.82 10.59±10.12 重度吸煙組 266 6.14±1.03 98.21±18.74＊52.38±14.33 12.29±14.81

五、不吸煙組與不同吸煙年限組間精子形態學比較

不吸煙組的正常精子率及各段異常精子率與短煙齡組及中、長煙齡組相比無顯著性差異（P ＞0.05），而長煙齡組的頭部精子缺陷率顯著高于不吸煙組（P＜0.05）（表4）。

六、吸煙組與不吸煙組精子DNA 完整性比較

隨機選取200例男性患者，進行精子DNA 完整性檢測，其中不吸煙者98例，吸煙者102例。吸煙組中DNA 完整精子比例為34%，顯著低于不吸煙組（77%）（P＜0.05）（圖1）。

七、精子DNA 完整性與精液濃度及活力的相關性

精子DNA 完整性與男性精液濃度及前向運動精子率之間存在一定程度的相關性（P ＜0.05）（表5）。

表4 不吸煙組與不同吸煙年限組間精子形態學比較（±s）

表4 不吸煙組與不同吸煙年限組間精子形態學比較（±s）

注：與不吸煙組比較，＊P＜0.05

組 別 例數 正常形態精子（%） 頭部缺陷精子（%） 中段缺陷精子（%） 尾部缺陷精子（%）不吸煙組 287 7.21±1.48 82.50±10.66 41.28±9.58 6.13±7.49短煙齡組 238 7.42±1.22 80.91±14.75 47.88±8.96 11.59±9.61中煙齡組 269 6.49±1.16 88.17±11.77 51.94±10.26 9.27±11.17長煙齡組 334 5.19±1.27 99.43±16.38＊52.50±9.73 11.31±12.09

表5 精子DNA 雙鏈精子百分率與精液濃度及活力的相關性（±s）

表5 精子DNA 雙鏈精子百分率與精液濃度及活力的相關性（±s）

參數 均數±標準差 相關系數P DNA 雙鏈精子比率0.57±0.01 - -精液濃度 39.28±15.32 0.038 0.013前向運動精子率22.17±9.32 0.041 0.028

圖1 吸煙組與不吸煙組精子DNA 完整性比較

八、精子Chk1 基因mRNA 相對表達量的檢測

行Chk1基因mRNA 相對表達量檢測，其中不吸煙者98例，吸煙者102例。吸煙組患者較不吸煙組患者Chk1基因mRNA 相對表達量低，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 吸煙組與不吸煙組Chk1基因mRNA 相對表達量

九、精子Chk1基因mRNA 相對表達量與精液濃度及活力的相關性

精子Chk1 基因mRNA 相對表達量與男性精液濃度及前向運動精子率間存在正相關（P＜0.05）（表6）。

表6 精子Chk1基因mRNA 相對表達量與精液濃度及活力的相關性（±s）

表6 精子Chk1基因mRNA 相對表達量與精液濃度及活力的相關性（±s）

參 數 均數±標準差 相關系數P Chk1基因mRNA 相對表達量1.42±0.18 - -精液濃度 39.28±15.32 0.048 0.027前向運動精子率22.17±9.32 0.039 0.015

討 論

吸煙是重要的環境危險因素，不僅可誘發肺癌、導致心血管疾病［4-5］，還可引起女性生育能力降低，同時由于香煙煙霧中含有多種有毒化學物質，極易對睪丸正常的生精過程造成干擾，導致精液質量的下降，進而造成精子致孕力降低［6-7］。

現已證實，香煙中的尼古丁及有毒化合物可導致ROS在精漿內過量積聚。過量ROS一方面可直接導致DNA 損傷，另一方面還可引發DNA 雙鏈斷裂或通過DNA 鏈、遺傳物質重塑、細胞退化等機制，最終導致DNA 損傷［8］。對精子細胞而言，DNA的完整性不僅保證了遺傳信息的完整性，同時也對精子細胞的結構和形態有著重要的影響。本研究通過對吸煙及不吸煙患者精液常規參數比較及精子DNA 完整性與精液常規參數之間的相關性分析發現吸煙可引起男性精液質量下降，且隨著吸煙時間的延長及日吸煙量的增加，精液質量下降更為顯著。同時，通過相關性分析發現吸煙引發的精液質量下降與精子DNA 完整性存在一定的相關性，這表明DNA 完整性異常可能是導致吸煙男性精液質量下降的危險因素之一。因此，DNA 損傷后修復作為DNA 完整性的調控因素，在吸煙所致精液質量下降的機制過程中顯得至關重要。

Chk1蛋白是生物進化過程中非常保守的蛋白激酶，其主要功能在于參與DNA 損傷引起的細胞周期檢測點的調節［9-11］。Chk1參與細胞周期檢查點的主要機制是通過與其上游蛋白激酶ATR 組成的信號通路在DNA 復制檢查點及DNA 損傷檢查點中發揮作用［12］。而DNA 損傷檢查點可保證基因組DNA 損傷時，細胞可進行及時響應、延遲，甚至停滯細胞周期進程，同時還可相應的啟動DNA 損傷的修復［13］。Chk1是G2-DNA 損傷校驗的核心，并通過Cdc25C的磷酸化對DNA 損傷進行應答，進而對受損的DNA 進行有效修復，修復成功則繼續進入細胞周期［2］。腫瘤研究中發現，Chk1基因的表達下降或失活將導致細胞損傷修復的缺失，進而引發DNA 損傷檢測點失去作用［14］。然而吸煙男性精液質量降低是否與Chk1的調節修復機制相關，目前尚未見報道。

在本研究中發現吸煙組患者較不吸煙組患者Chk1基因mRNA 相對表達量降低且精子Chk1基因mRNA 相對表達量與男性精液濃度及前向運動精子率間存在一定程度的相關性。這一研究結果表明，在精子的調控中可能存在Chk1調控通路，即通過Chk1對精子損傷的DNA 進行檢測修復。長期大量吸煙可能引發精子細胞內Chk1基因表達減少或缺失，進而導致DNA 受損傷的精子不能實現G2M 期停滯，進而不能得到有效的修復，引發精液質量的下降。

綜上所述，Chk1基因表達下調與吸煙男性精液質量的相關性研究將為揭示吸煙引發男性生育能力降低的研究拓展又一新的方向。然而吸煙引發Chk1基因缺失或抑制的機理及Chk1基因的DNA修復功能尚需進一步研究。本研究利用分子生物學技術揭示吸煙男性精液質量下降的相關因素，為深入探討吸煙引起的精子DNA 損傷在分子生物學水平的研究奠定基礎。

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