小鼠卵母細胞中14-3-3蛋白亞型的表達

孟峻，侯艷軍，張永梅，呼格吉樂，劉洋，宿瑞俊

（內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，呼和浩特 010050）

14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物體內、分子量約為28～33kDa的酸性蛋白質［1］。14-3-3蛋白家族成員是在1967 年由Moore和Perez［2］首次在哺乳動物的腦組織中發現并鑒定，按照蛋白質的系統分類命名法命名為14-3-3蛋白。隨著對14-3-3蛋白的深入研究，發現它不僅僅是一種存在于腦組織中的蛋白，而且也廣泛存在于其他各種組織中。14-3-3蛋白高度保守，在哺乳動物中發現7個家族成員，分別為β，γ，ε，σ，ζ，τ和η，并且由7個不同的基因編碼［3-4］。近年來，有大量關于人和小鼠的14-3-3蛋白通過細胞分裂周期磷酸酶25B（Cdc25B）調控細胞周期進程的報道，且成為研究的熱點［5-6］。已有 文 獻 報 道［7-8］Cdc25B 能 使Cdc2（cell division cycle 2）上酪氨酸-15（Tyr-15）和蘇氨酸-14（Thr-14）脫磷酸從而激活Cdc2，促進小鼠卵母細胞恢復減數分裂。但是小鼠卵母細胞中是否表達14-3-3蛋白以及各亞型的表達情況目前國內外未見文獻報道，而且在小鼠卵母細胞中14-3-3 蛋白是否通過Cdc25B磷酸酶調控小鼠卵母細胞恢復減數分裂也知者甚少。本研究對小鼠卵母細胞14-3-3蛋白的表達亞型進行鑒定，確定主要的表達亞型，以期為今后研究14-3-3蛋白調控小鼠卵母細胞G2／M 轉換中作用的研究做前期的準備工作。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：SPF 級昆明系小白鼠，雌性3～4周齡，由內蒙古大學實驗動物部提供。動物飼養溫度20～22℃，濕度50%～70%，光照周期12h／12h，自由進食和飲水。

2.實驗材料及主要試劑：M2培養液、礦物油、丙酮酸鈉（Sigma，美國），Waymouth MB 752／1（Invitrogen，美國），孕馬血清促性腺激素（PMSG，寧波激素三廠），快速微量mRNA 提取純化試劑盒（GE Healthcare，美國），RNA PCR Kit（AMV）Ver3.0（TakaRa，日本），ECL 發光試劑盒（Pierce，美國），兔抗小鼠14-3-3ε抗體（Abcam，英國），山羊抗小鼠14-3-3β抗體（Cell signaling，美國），HRP 偶聯的兔抗山羊IgG 或羊抗兔IgG 二抗（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗小鼠β-Actin抗體（Santa Cruz，美國），PCR 擴增引物的合成與DNA 測序均由上海生工公司完成。

二、研究方法

1.小鼠卵母細胞的采集和培養：根據Zhang等［7］的方法進行小鼠超排卵、收集和培養。3～4周齡的昆明系雌性白鼠，腹腔注射孕馬血清（PMSG）10U／只，48h后脫頸法處死，快速取出卵巢，放于M2培養液（含125μmol／L 二丁烯環一磷酸腺苷，防止生發泡破裂）中，在體視顯微鏡下用1ml注射器針頭將卵巢撕碎，讓卵母細胞自然流出，用口吸管反復吹打去除附著的顆粒細胞，獲得裸卵母細胞，即GV 期卵母細胞，在PBS中洗3次，取一半GV 期卵母細胞用于mRNA 的提取，另一半GV 期卵母細胞在MB培養液［7］（在Waymouth MB752／1培養液的基礎上添加100μg／ml丙酮酸鈉，50U／ml青霉素，50μg／ml鏈霉素，3 mg／ml BSA，此培養液簡稱為MB培養液）中培養，上覆礦物油以防蒸發，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內培養以獲得生發泡破裂期（GVBD）卵母細胞，提取mRNA。

2.提取總mRNA：將100 個GV／GVBD 期卵母細胞收集到2ml離心管中，按EllustraTMQuick-Prep MicromRNA Purification試劑盒（GE Healthcare，美國）說明書進行：主要包括：樣品的提取，mRNA 的分離，分別用高鹽緩沖液和低鹽緩沖液對已結合mRNA 的oligo（dT）纖維顆粒的洗滌，mRNA的洗脫。

3.引物設計：根據NCBI網站Blast對7個14-3-3亞型進行引物設計

表1 檢測14-3-3各個亞型的引物序列

4.RT-PCR 法 檢 測mRNA 水 平：用TaKaRa RNAPCR（AMV）ver 3.0試劑盒，按操作步驟進行反轉錄和PCR，RT-PCR 反應體系為MgCl22μl，10×RTbuffer 1μl去酶dH2O 3.75μl，逆轉錄酶0.5μl，dNTP 1μl，酶抑制劑0.25μl，dT-adaptor primer 0.5μl，mRNA 1μl，補ddH2O 至10μl，反應條件為：42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min。PCR反應體系為5×PCR buffer 5μl，Taq 酶0.15μl，上游引物（20pmol／L）0.25μl，下游引物（20pmol／L）0.25μl，cDNA模板5μl，補ddH2O 至25μl，反應條件是：94℃，3min；循環為94℃30s，50℃30s，72℃1min，30～31 個循環；72℃，10 min。反應產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

5.Western蛋白印跡法檢測蛋白表達水平：收集GV 期和GVBD 期的小鼠卵母細胞各200枚，轉移到1.5ml Eppendorf管中，4℃離心去除培養液，加入20μl蛋白提取緩沖液，反復凍融裂解，加入SDS 樣 品 緩 沖 液，100℃煮 沸5 min，12% SDSPAGE 電泳分離，轉膜，用含5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖液＋Tween20（TBST）（pH7.4）室溫封閉1～2h。封閉后的濾膜與山羊抗小鼠14-3-3β抗體（1∶1 000稀釋）或兔抗小鼠14-3-3ε抗體（1∶800稀釋）及內參β-Actin抗體（1∶200稀釋）4℃孵育過夜。HRP偶聯的兔抗山羊IgG 或羊抗兔IgG 作為二抗，室溫孵育2h。洗膜后，用增強化學發光檢測試劑盒（ECL detection kit，Millipore，美國）顯影成像。

三、統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。每組實驗重復3～4次，數據以均數±標準差（±s）表示。組間差異采用t 檢驗和χ2檢驗（Chi-square test）進行統計，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、小鼠卵母細胞中7 個14-3-3 蛋白亞型的mRNA 表達水平的檢測

結果顯示，小鼠GV 期卵母細胞中在mRNA 水平上只有14-3-3β和14-3-3ε亞型存在，而且14-3-3ε mRNA 水平顯著高于14-3-3β（P＜0.01）（圖1）。14-3-3ε的mRNA 表 達 在GV 期 和GVBD 期 差 異無統計學意義（P＞0.05）（圖2）。

圖1 小鼠GV 期卵母細胞中7個14-3-3亞型mRNA 表達比較

圖2 小鼠GV、GVBD 期卵母細胞中14-3-3ε的mRNA 表達

二、小鼠卵母細胞中的14-3-3ε和14-3-3β蛋白表達水平

在小鼠GV 期和GVBD 期卵母細胞中又進一步檢測了14-3-3ε和14-3-3β的蛋白表達。結果顯示，GV 期和GVBD 期卵母細胞中14-3-3ε的蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3），這與mRNA 表達結果一致。14-3-3β 蛋白的表達非常低，Western blotting沒有檢測到14-3-3β蛋白的存在（圖4）。

圖3 小鼠GV 期和GVBD 期卵母細胞中14-3-3ε蛋白的表達水平

圖4 小鼠GV 期和GVBD 期卵母細胞中14-3-3β蛋白的表達水平

討 論

小鼠卵母細胞發育成熟過程中停滯于生發泡期，也稱GV 期，相當于有絲分裂的G2 期末［9］，在激素的刺激下，部分卵母細胞發生生發泡破裂（GVBD），即恢復第一次減數分裂。對爪蟾卵母細胞的研究表明［10-12］，在GV 期阻滯的卵母細胞中，減數分裂的啟動子M 期促進因子（MPF）的催化亞基Cdc2-Thr14／Tyr15被磷酸化，MPF 的活性受到抑制，PKA（蛋白激酶A）可直接磷酸化Cdc25的287位絲氨酸，此位點磷酸化后導致14-3-3 蛋白的結合，Cdc25 活性受抑，不能入核使Cdc2 的Thr14／Tyr15脫磷酸，因而不能激活MPF，卵母細胞發生GV 期阻滯。小鼠卵母細胞的研究證實，PKA 通過Cdc25B的321位絲氨酸磷酸化修飾引起GV 期阻滯，PKA／Cdc25B通路在小鼠卵母細胞減數分裂中發揮重要作用，Cdc25B 能促進減數分裂的重新啟動，其突變體（S321A）能完全解除PKA 引起的GV期阻滯［13-15］。然而，小鼠卵母細胞中是否存在14-3-3蛋白以及14-3-3蛋白是否與Cdc25B 結合而使小鼠卵母細胞阻滯于GV 期（相當于有絲分裂的G2期），國內外未見報道。本研究以小鼠卵母細胞為研究對象，利用分子生物學技術和方法鑒定了小鼠GV 期卵母細胞中14-3-3蛋白各亞型的表達情況，證實了小鼠卵母細胞中確實表達14-3-3蛋白，而且14-3-3ε是主要的表達亞型。最近我們課題組通過質譜分析證實PKA 在體外能磷酸化小鼠Cdc25B的321位絲氨酸［16］，即Cdc25B是PKA 的直接作用底物。Uchida等［17］人的實驗結果顯示，在HEK293細胞中14-3-3ε能與Cdc25B 的309 位絲氨酸結合并且控制Cdc25B 的細胞質定位。結合以前的研究［13-15，18］，我們可以推測：在小鼠GV 期卵母細胞中PKA 磷酸化Cdc25B 的321位絲氨酸后與14-3-3ε結合，二者共定位于細胞質，Cdc25B 不能入核使Cdc2的Thr14／Tyr15脫磷酸，因而不能激活MPF，卵母細胞阻滯于GV 期。文獻［7］報道，在小鼠GV期卵母細胞中Cdc25B 定位于細胞質，GVBD 前Cdc25B定位于細胞核，GVBD 后定位于整個細胞；Cdc25B的突變體Cdc25B-S321A 在GV 期不能定位于細胞質而是定位于細胞核。上述實驗進一步暗示14-3-3ε可能和磷酸化S321-Cdc25B 結合于小鼠卵母細胞的細胞質，Cdc25B 不能入核，使卵母細胞阻滯于GV 期。這只是我們提出的假設，需要進一步的后續實驗證明。

總之，本研究證實了小鼠GV 期卵母細胞中14-3-3ε的表達，這為我們今后研究PKA／Cdc25B／14-3-3ε通路在小鼠卵母細胞GV 期阻滯中作用的研究提供了實驗依據，這一通路的研究對小鼠一細胞期受精卵發育機制的研究具有重要的參考價值，為人類輔助生殖技術尤其是不孕不育的治療提供了理論基礎。

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