培養液中不同蛋白添加物對IVF／ICSI-ET 植入前胚胎發育及臨床妊娠結局的影響

唐寧，孔令北，劉海萍，王建業＊

（1.濟南軍區總醫院生殖醫學中心，濟南 250031；2.山東濟寧兗州區第一中學生物組，濟寧 272100）

在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）中，獲得高質量、發育潛能良好的胚胎是得到好的臨床妊娠結局的關鍵。一直以來，認為培養液的質量是體外胚胎培養的關鍵，這包括培養液的溫度、滲透壓、pH 值以及培養液的組成成分等［1-8］。而在培養液的組成成分中，蛋白添加物必不可少。血清替代補充成分（SSS）和人血清白蛋白（HSA）是兩種非常常用的蛋白添加物，有必要對其在體外受精／卵胞漿內單精子注射-胚胎移植（IVF／ICSI-ET）中的作用作進一步地探討。

一、材料與方法

1.研究對象：回顧性分析2013年5月1日至2013年9 月30 日 及2014 年5 月1 日 至2014 年9月30 日在本中心行IVF／ICSI-ET 的患者。所有納入患者均使用短方案超排卵，女方不孕因素為輸卵管因素，移植日為取卵后第3天。所有患者均施行新鮮胚胎移植。

2.分組：本中心所有胚胎培養均使用瑞典Vitrolife序貫培養液。根據培養液蛋白添加物的不同，將患者分為HSA 組（以10%HSA 作為胚胎培養液添加物）和SSS組（以20%SSS作為胚胎培養液添加物），其中2013年的患者為HSA 組，而2014年的患者為SSS組。

3.診療方法回顧：使用本中心已建立的方法［9］。具體為：經本中心常規方法超排卵后，當主導卵泡直徑達18 mm 時，肌肉注射HCG 5 000～10 000U；HCG 注射后36～40h，于超聲引導下經陰道取卵；取卵后3～5h行IVF 或4～6h行ICSI授精，授精后18～20h觀察受精情況；授精后68～70h觀察胚胎卵裂球的數目和碎片多少，并以此為根據判定胚胎的級別，分為Ⅰ級胚胎（卵裂球大小均勻，胞漿碎片＜10%）、Ⅱ級胚胎（卵裂球大小略不均勻，胞漿碎片＜15%）、Ⅲ級胚胎（胞漿碎片＜50%，卵裂球的情況類似于Ⅱ級胚胎）和Ⅳ級胚胎（胞漿碎片＞50%）。胚胎達6 細胞以上，Ⅰ級和Ⅱ級胚胎為優質胚胎。

取卵后第3 天進行ET，移植時優先選用優質胚胎。移植胚胎的數目嚴格按照國家標準，即：患者年齡＜35歲，移植2個胚胎；患者年齡≥35 歲或患者處于2個以上（包括2個）移植周期，移植3個胚胎。移植后給予黃體酮支持黃體功能，2周后測尿HCG，陽性者為生化妊娠，5周后B超檢查胚囊數，見孕囊及胚芽即診斷為臨床妊娠。

4.觀察指標：將行IVF和ICSI的患者分別進行患者基本情況、胚胎發育和妊娠情況的比較，統計學分析其差異。患者的基本情況包括年齡、不孕年限、平均促性腺激素（Gn）量、Gn使用天數、獲卵數；胚胎發育情況包括受精率、卵裂率、優質率、移植胚胎數和胚胎冷凍率；妊娠情況包括妊娠率和著床率。

IVF的受精率＝（雙原核胚胎數＋單原核胚胎數＋多原核胚胎數）／總取卵數×100%；ICSI的受精率＝（雙原核胚胎數＋單原核胚胎數＋多原核胚胎數）／MⅡ期卵母細胞數×100%；卵裂率＝卵裂胚胎數／（雙原核胚胎數＋單原核胚胎數＋多原核胚胎數）×100%；優胚率＝優質胚胎數／卵裂胚胎數×100%；妊娠率＝臨床妊娠數／患者總人數×100%；著床率＝孕囊或胚芽數／移植胚胎總數×100%；胚胎冷凍率＝移植后有冷凍胚胎的病例數／總例數×100%。

5.統計方法：使用SPSS 10.0進行分析。定量資料結果以平均值±標準誤表示；定量資料使用成組設計的t檢驗，定性資料使用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1.行IVF-ET 的患者：SSS 組與HSA 組的患者年齡、不孕年限、平均Gn量、使用天數和獲卵數均無統計學差異（P＞0.05）（表1）；兩組患者的受精率、卵裂率、移植胚胎數、妊娠率和著床率均無統計學差異（P＞0.05），而SSS組的胚胎冷凍率、優胚率均顯著高于HSA 組（P＜0.05）（表2）。SSS可促進植入前胚胎的發育但不能改善IVF-ET 臨床妊娠結局。

2.行ICSI-ET的患者：SSS組與HSA 組在不孕年限、平均Gn量和使用天數上無統計學差異（P＞0.05），但SSS組患者年齡顯著高于HSA 組（P＜0.05），且SSS組的獲卵數顯著低于HSA 組（P＜0.05）（表3）；兩組患者受精率、卵裂率和妊娠率均無統計學差異（P＞0.05），但SSS組的冷凍率和優胚率均顯著高于HSA 組（P＜0.05），而SSS組著床率顯著低于HSA 組（P＜0.05）（表4）。SSS能促進ICSI后胚胎早期發育，提高卵母細胞的利用率。

3.年齡對行ICSI-ET 的患者妊娠情況的影響：由于SSS組患者的年齡高于HSA 組、著床率低于HSA 組，為進一步探討年齡對妊娠結局的影響，接受ICSI的患者按年齡分成＜35 歲組和≥35歲組，對不同年齡組中SSS和HSA 對妊娠結局的影響分別進行分析。結果顯示，無論在＜35歲 組 中，還 是 在≥35 歲 組 中，SSS 和HSA 對妊娠率和著床率的影響均無統計學差異（P＞0.05）（表5）。

表1 IVF患者基本情況（±s）

表1 IVF患者基本情況（±s）

組 別 例數 年齡（歲） 不孕年限（年） 平均Gn量（支） 使用天數（d） 獲卵數（個）12 9.89±0.27 SSS組 622 31.65±0.21 4.06±0.11 27.91±0.42 9.83±0.HSA 組 467 31.83±0.24 4.15±0.14 27.34±0.53 9.66±0.11 9.62±0.24

表2 IVF患者胚胎發育及妊娠情況［（±s），%］）

表2 IVF患者胚胎發育及妊娠情況［（±s），%］）

注：與HSA 組比較，＊P＜0.05

組別 例數 胚胎總數（個）受精率 卵裂率 優胚率 移植胚胎數（個）著床率 妊娠率 胚胎冷凍率.66 68.74 SSS組 622 5 983 79.13 94.38 63.20＊ 1.98±0.036 34.34 53.72 76.58 HSA 組 467 4 618 79.78 94.13 50.39 2.01±0.034 33.16 49＊

表3 ICSI患者基本情況（±s）

表3 ICSI患者基本情況（±s）

注：與HSA 組比較，＊P＜0.05

組別 例數 年齡（歲） 不孕年限（年） 平均Gn量（支） 使用天數（d） 獲卵數（個）14 9.35±0.31 SSS組 457 32.76±0.28＊ 4.46±0.17 27.20±0.51 9.26±0.13 8.28±0.26 HSA 組 286 30.03±0.31 4.51±0.20 28.01±0.58 9.53±0.＊

表4 ICSI患者胚胎發育及妊娠情況［（±s），%］）

表4 ICSI患者胚胎發育及妊娠情況［（±s），%］）

注：與HSA 組比較，＊P＜0.05

組別 例數 胚胎總數（個）受精率 卵裂率 優胚率 移植胚胎數（個）著床率 妊娠率 胚胎冷凍率18 60.09 SSS組 457 3 784 86.05 95.92 61.80＊ 2.00±0.04＊24.29＊ 41.95 68.29 HSA 組 286 2 674 84.79 95.07 51.12 2.19±0.04 29.23 46.＊

表5 兩種蛋白添加物對不同年齡組ISCI患者妊娠情況的影響（%）

三、討論

胚胎的生長環境，尤其是培養胚胎的培養液一直是IVF-ET 的關鍵。一旦出現不理想的臨床妊娠結局，輔助生殖工作者首先考慮的就是胚胎培養液是否出了問題或者培養環境是否有變化。一直以來，研究者都在不停地研究如何改進現有的培養液，以期獲得更好的、有發育潛能的胚胎，進而改善臨床妊娠結局。胚胎培養液中蛋白添加物的加入有助于獲得更好的優質胚胎。培養液中最早使用的蛋白添加物是母源性的血清蛋白，而后發展為人血清白蛋白（HSA 和Buminate），再后人們開始使用蛋白替代物（包 括SSS、SPS、LGPS 等）。現 在，HSA 和SSS是各生殖中心胚胎培養最常用的蛋白添加物。

1995年有研究顯示，和HSA 相比，添加了SSS的胚胎培養液在提高受精率和胚胎形態學質量方面并沒有優勢［10］，但第2年對小鼠的研究則證實，SSS能促進小鼠胚胎生長，具有和血清同樣的效果［11］，而同年的臨床回顧性分析研究則表明：相對于母源血清和人血漿蛋白粉（Plasmanate），SSS 能提高胚胎的種植率，從而獲得更好的臨床妊娠結局［12］。2009年，有研究者證明，與單純添加HSA 相比，SSS和HSA 的共同添加能提高胚胎的植入率并能提高最終的活產率［13］。與前述研究相一致的是，我們的研究表明：與HSA 相比，SSS能促進IVF／ISCI后植入前胚胎的發育，增加優質胚胎和可用胚胎的數量，提高所獲取的卵母細胞的利用率。冷凍胚胎的增多意味著患者若在本治療周期未獲得妊娠，可以使用自然周期或者人工周期準備內膜，而后進行胚胎復蘇移植，大大節省治療的時間和患者的花費。

但我們的研究同樣也表明，在IVF-ET 中，SSS的加入并沒有提高胚胎的植入率，也未改善臨床妊娠結局，這可能與移植時都是盡量選用優質胚胎有關。在ICSI-ET 患者中，SSS組的植入率甚至要低于HSA 組，這可能是因為SSS組患者的年齡顯著地高于HSA 組。而后分年齡階段的統計分析顯示，在不同年齡組（＜35 組和≥35 歲組），SSS 和HSA 對臨床妊娠率和胚胎著床率的影響沒有統計學差異，進一步證實ICSI組臨床妊娠結局的主要是受患者年齡的影響。而造成年齡差異的根本原因可能是自2013年底，山東省通過了單獨二孩的計劃生育政策，這使得大量年齡偏大的育齡婦女求助于輔助生殖技術來實現自己的二胎夢，年齡的偏大造成了卵巢功能的低下，超排卵后獲得的卵母細胞數目也明顯減少，以至于在移植時可用胚胎的數目也明顯降低。

對SSS作用機理的研究顯示，培養液中SSS的加入可以提高囊胚的孵出率，降低活性氧自由基的水平，減少胚胎卵裂球的凋亡［14］，此外SSS對植入前胚胎發育的促進作用也可能與SSS 中氨基酸含量較高有關［15］。

總之，SSS能促進IVF／ICSI-ET 中植入前胚胎的發育，提高卵母細胞的利用率，可以作為優化胚胎培養方案的蛋白添加物。

［1］ Hong KH，Lee H，Forman EJ，et al.Examining the temperature of embryo culture in in vitro fertilization：a randomized controlled trial comparing traditional core temperature（37 ℃）to a more physiologic，cooler temperature（36 ℃）［J］.Fertil Steril，2014，102：767-773.

［2］ Lee JS，Kim JH，Seo YS，et al.The influence of serum substituents on serum-free Vero cell conditioned culture media manufactured from Dulbecco’s modified Eagle medium in mouse embryo culture［J］.Obstet Gynecol Sci，2013，56：320-329.

［3］ Hentemann M，Mousavi K，Bertheussen K.Differential pH in embryo culture［J］.Fertil Steril，2011，95：1291-1294.

［4］ Swain J.Embryo culture and pH［J］.Fertil Steril，2011，95：e67-e68.

［5］ Swain JE.Optimizing the culture environment in the IVF laboratory：impact of pH and buffer capacity on gamete and embryo quality［J／OL］.Reprod Biomed Online，2010，21：6-16.

［6］ Swain JE，Pool TB.New pH-buffering system for media utilized during gamete and embryo manipulations for assisted reproduction［J／OL］.Reprod Biomed Online，2009，18：799-810.

［7］ Edwards LJ，Williams DA，Gardner DK.Intracellular pH of the preimplantation mouse embryo：effects of extracellular pH and weak acids［J］.Mol Reprod Dev，1998，50：434-442.

［8］ Johnston LA，Donoghue AM，O’Brien SJ，et al.Influence of temperature and gas atmosphere on in-vitro fertilization and embryo development in domestic cats［J］.J Reprod Fertil，1991，92：377-382.

［9］ 唐寧，王建業，呂丹，等.授精后24-25h原核融合與IVF／ICSI-ET中胚胎早期發育和妊娠結局的相關性研究［J］.中國優生與遺傳雜志，2013，21：121-123.

［10］ Graham MC，Partridge AB，Lewis V，et al.A prospective comparison of Synthetic Serum Substitute and human serum albumin in culture for in vitro fertilization-embryo transfer［J］.Fertil Steril，1995，64：1036-1038.

［11］ Tucker KE，Hurst BS，Guadagnoli S，et al.Evaluation of synthetic serum substitute versus serum as protein supplementation for mouse and human embryo culture［J］.J Assist Reprod Genet，1996，13：32-37.

［12］ Desai NN，Sheean LA，Martin D，et al.Clinical experience with synthetic serum substitute as a protein supplement in IVF culture media：a retrospective study［J］.J Assist Reprod Genet，1996，13：23-31.

［13］ Meintjes M，Chantilis SJ，Ward DC，et al.A randomized controlled study of human serum albumin and serum substitute supplement as protein supplements for IVF culture and the effect on live birth rates［J］.Hum Reprod，2009，24：782-789.

［14］ Esfandiari N，Falcone T，Agarwal A，et al.Protein supplementation and the incidence of apoptosis and oxidative stress in mouse embryos［J］.Obstet Gynecol，2005，105：653-660.

［15］ Morbeck DE，Paczkowski M，Fredrickson JR，et al.Composition of protein supplements used for human embryo culture［J］.J Assist Reprod Genet，2014，31：1703-1711.