D3非優質胚胎的冷凍價值及其臨床結局分析

丁錦麗，楊菁＊，張艷，張怡，徐望明，龍文

（1.武漢大學人民醫院生殖醫學中心，武漢 430060；2.華中科技大學同濟醫學院計劃生育研究所，武漢 430030）

許多因素影響到體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的結局，如婦女年齡、子宮內膜容受性及內膜與胚胎發育的同步性、移植胚胎的數量等［1-3］，而胚胎質量是一個重要因素［4］。有研究報道約70%的患者在IVF-ET 過程中獲得非優質胚胎［5］，由于非優質胚胎的發育潛能較低，再利用的可能性不大，所以有的生殖中心選擇將其丟棄。關于非優質胚胎的臨床利用價值尚存在較大爭議，有研究證實非優質胚胎經體外培養后可能發育成囊胚［6］。本研究分析了在我中心行非優質胚胎移植的135 個凍融胚胎移植（FET）周期，分析其臨床結局及可能的影響因素，探討非優質胚胎的冷凍／移植價值，為臨床工作提供參考。

資料與方法

一、研究對象

收集2010年1月至2012年12月在武漢大學人民醫院生殖醫學中心144例行非優質胚胎FET夫婦的資料，并納入2011年1月至2011年10月行優質胚胎FET 的202對夫婦作為對照。排除子宮肌瘤、子宮內膜異位癥和其他可能影響胚胎著床的因素，如男方和／或女方染色體異常；排除供胚移植的患者。患者年齡21～43歲，不孕年限1～17年。

二、治療方法回顧

1.促排卵及受精：采用我中心常規使用的短方案、長方案、超長方案促排［7］。超聲檢查發現有3個以上直徑≥18mm 的卵泡時，予以5 000～10 000U劑量的HCG（雪蘭諾，瑞士），36h后在陰道超聲引導下采卵。根據男方精子質量決定自然受精或卵胞漿內單精子注射（ICSI）受精。

2.胚胎凍融及培養：采用本中心常規方案［8］，選擇正常受精第3天的胚胎冷凍保存。玻璃化法冷凍按試劑盒（Kitazato，日本）操作程序進行。胚胎解凍后繼續培養18～24h，再行移植。按解凍試劑盒（Kitazato，日本）說明書解凍胚胎，再轉入Quinn’s培養液（SAGE，美國）培養。

3.胚胎質量評估：D3、解凍后、移植時各評估1次。根胚胎形態學對胚胎進行分級：解凍前評估時包含6個以上均勻一致的卵裂球且細胞碎片小于20%的胚胎定義為優質胚胎［8］，其余為非優質胚胎，包括大小不一的卵裂球5個（4或4以下）且胚胎碎片＞20%的非優質胚胎，即5B（4B 或4B 以下）胚胎。

4.內膜準備及胚胎移植：內膜準備方案包括人工周期和自然周期。月經正常的患者于月經周期第11天陰道超聲監測卵泡發育，當卵泡直徑≥14mm時開始查血清促黃體生成素（LH），LH 峰值出現后3d行FET；對于月經不規則的患者于月經周期第2～3天行陰道超聲監測，根據患者的個體情況決定戊酸雌二醇（補佳樂，先靈，德國）的起始用量，依激素水平調整補佳樂的用量，待超聲監測內膜≥8mm時肌注黃體酮，具體用藥參考本中心常規方案［8］。

根據患者年齡、內膜準備情況等決定移植胚胎數，一般為2～3枚。所有患者在移植后均肌注黃體酮行黃體支持及口服戊酸雌二醇。胚胎移植后14d檢測血β-HCG＞10U／L，2周后B超下見孕囊確定為臨床妊娠。

三、分析指標

本項研究收集并分析了兩組患者年齡、周期數、不孕年限、體重指數（BMI）、HCG 日子宮內膜厚度、移植胚胎數、著床數以及胚胎解凍后繼續培養的結果等資料。

判斷標準及計算方法：移植前50%以上胚胎卵裂球透亮為胚胎存活［5］；移植時胚胎細胞數與D3胚胎細胞數一致或小于D3胚胎細胞數定義為胚胎未生長；移植時胚胎細胞數大于D3 胚胎細胞數或移植時發育為囊胚定義為胚胎繼續生長；移植時形成囊胚的比例定義為形成囊胚的胚胎數／解凍后存活的胚胎數；胚胎種植率定義為超聲掃描可見孕囊數／移植胚胎數；臨床妊娠率定義為臨床妊娠例數／總周期數；流產率為流產例數／臨床妊娠例數。

四、統計學分析

應用SPSS 19.0統計學軟件進行分析。計數資料結果以均數±標準差表示，計量資料以率表示。定量資料比較采用t檢驗，定性資料的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、患者基礎資料及臨床結局

本項回顧性研究共納入346個凍胚移植周期，其中，非優質組144個周期，優質組202個周期，兩組分別取消了9個和8個周期。

兩組間不孕年限、HCG 日內膜厚度、移植胚胎數均無統計學差異（P＞0.05）；非優質組女方年齡明顯高于優質組（P＜0.05）（表1）。

二、胚胎解凍后繼續培養情況

非優質組胚胎解凍后存活率為95.86%（324／338），優 質 組 胚 胎 解 凍 后 存 活 率96.07%（464／483），組間無統計學差異（P＞0.05）。兩組因解凍及培養過程中胚胎溶解而取消周期的比例分別為6.25%和3.96%，組間無統計學差異（P＞0.05）（表2）。

非優質胚胎解凍后存活324枚，其中卵裂球繼續分裂的胚胎238枚（2枚發育為囊胚），86枚胚胎未生長；優質胚胎解凍后存活464枚，其中未生長胚胎72枚，19枚在移植時發育為囊胚。兩組胚胎未生長比例（26.54%vs.15.52%）和移植時形成囊胚的比例（0.62%vs.4.10%）均有統計學差異（P＜0.05）（表2）。

三、兩組患者妊娠結局比較

135個非優質胚胎移植周期中，共移植322 枚胚 胎，種 植 率13.66% （44／322），臨 床 妊 娠 率26.67%（36／135），流產率8.33%（3／36）；194個優質胚胎移植周期中，共移植459 枚胚胎，種植率30.28%（139／459），臨 床 妊 娠 率51.55% （100／194），流產率為7.00%（7／100）。兩組間種植率、臨床妊娠率均有顯著差異（P＜0.001），而組間流產率無顯著差異（P＞0.05）（表3）。

四、非優質胚胎的組成情況及其解凍結局

135個非優質胚胎移植周期中，共移植胚胎322枚，其中4B以下胚胎1枚，4B胚胎181枚，5B胚胎140枚。44枚胚胎著床。

5B組胚胎解凍后存活率顯著高于4B 組（P＜0.001）；與4B胚胎組相比，5B胚胎組未生長胚胎的比例較低，而繼續生長胚胎的比例較高，但無統計學差異（P＞0.05）（表4）。4B組有2枚胚胎解凍培養后形成囊胚。

五、不同內膜準備周期對非優質胚胎移植臨床結局的影響

135個非優質胚胎移植周期中，35個自然周期，100個人工內膜準備周期。人工與自然周期患者的年齡、不孕時間、BMI、移植胚胎數、妊娠率及種植率均無統計學差異（P＞0.05）（表5）。

表1 兩組患者基本資料（±s）

表1 兩組患者基本資料（±s）

注：與非優質組比較，＊P＜0.05

組 別 年齡（歲）不孕時間（年）BMI（kg／m2）移植胚胎（枚）內膜厚度（cm）原發不孕（%）繼發不孕（%）周期取消率（%）優質組 30.48±4.23＊ 4.79±3.60 21.85±3.11 2.37±0.57 0.85±0.14 48.45 51.55 3.96非優質組32.08±4.39 5.61±3.69 21.37±2.58 2.41±0.56 0.87±0.11 46.67 53.33 6.25

表2 胚胎解凍后繼續培養情況［n（%）］

表3 患者臨床結局［n（%）］

表4 非優質組胚胎的組成情況及解凍結局［n（%）］

表5 非優質組不同內膜準備方案的臨床結局（±s）

表5 非優質組不同內膜準備方案的臨床結局（±s）

組 別 周期數 年齡（歲） 不孕時間（年） BMI（kg／m2） 移植胚胎（枚） 種植率（%） 臨床妊娠率（%）自然周期 35 32.86±2.66 5.91±3.85 21.00±2.40 2.37±0.4 9 14.63 28.57人工周期 100 31.81±4.61 5.50±3.65 21.50±2.64 2.42±0.59 13.33 26.00

討 論

自1983年首例冷凍胚胎復蘇后移植成功分娩活嬰以來，FET 在輔助生殖技術中越來越受到重視，它不僅能在一定程度上避免中、重度卵巢過度刺激綜合征的發生，還能提高累計妊娠率，減少患者經濟負擔［9-11］。影響FET 臨床結局的因素有很多，包括胚胎的數目和質量、婦女年齡、患者子宮內膜的容受性等［1-3］。有研究表明，在所有因素中胚胎質量的影響最為顯著［4］。優質凍胚的種植率顯著高于非優質胚胎凍胚，非優質胚胎可能不能耐受凍存過程中降溫及復溫所帶來的損傷［12］，且發育潛能較差，所以有的中心選擇將非優質胚胎丟棄。然而，對于年齡較大及獲卵困難的患者來說，非優質胚胎的移植可能是其最好的助孕選擇之一。

在本項研究中，優質胚胎移植患者的種植率及臨床妊娠率均較非優質胚胎移植者高，且優質組移植時形成囊胚的比例也顯著高于非優質組，這與國內學者研究結果一致［5，13］。在此項研究中，非優質組移植時形成囊胚的比例為0.62%，2枚非優質胚胎（均為4B 胚胎）發育為囊胚，其中1 例妊娠。表明D3形態學評價為非優質的胚胎部分仍具有發育至囊胚的潛能。

胚胎質量較好者耐受胚胎降溫、復溫損傷的能力更強［14］，這可能是5B胚胎存活率顯著高于4B胚胎的原因之一。此項研究結果表明，在非優質胚胎周期中，胚胎解凍后繼續培養，5B 胚胎組的生長發育情況更好，而5B 以下胚胎繼續發育的可能性很低，可能的原因是早期胚胎的發育依賴于胚胎型基因的激活和母源性遺傳物質適時的表達，而2-細胞期是母型調控向合子型調控過渡的起始時期［15］，因此我們推測5B以下胚胎因為早期卵裂沒有適時發生，從而影響了胚胎的進一步發育。梁菊艷等［16］的研究表明，非優質周期中有囊胚形成的患者，其妊娠率顯著高于無囊胚形成的患者，提示其胚胎有較好的發育潛能，妊娠失敗的原因可能包括子宮內膜容受性、體內激素等方面。

本研究結果表明，解凍前評估為非優質的胚胎仍然有繼續發育的潛力，移植后仍有著床、繼續妊娠的可能，表明胚胎的發育潛能和胚胎形態并不完全一致。有研究證實胚胎形態學不能完全反映胚胎的質量，不能預測胚胎發育的潛能，形態學評分為優質胚胎的胚胎染色體異常的發生率高達25%［17］。我們的研究中4B以下的胚胎僅移植1枚，關于4B以下胚胎的發育潛能及冷凍價值需進一步研究。

胚胎移植的內膜準備包括自然周期和人工周期。關于不同內膜準備方案對FET 妊娠結局的影響存在爭議，在本項研究非優質組中兩種內膜準備方案的胚胎移植結局沒有統計學差異。

年齡是顯著影響女性生殖能力的一個因素［1］，FET 患者妊娠率隨著年齡的升高而下降［18］。在本研究中，非優質胚胎組患者的年齡顯著高于優質組，年齡越大獲得優質胚胎的幾率越小。年齡對女性生殖能力的影響主要在于對卵母細胞質量以及子宮內膜容受性的影響［19-21］：年齡的增加使卵母細胞非整倍體發生率也增加，這可能與卵母細胞紡錘體、線粒體老化，細胞非極性增加，同源染色體不分離、姐妹染色單體過早分離等有關［19-20］；且年齡的增加使子宮內膜發生一系列的變化，包括細胞中雌、孕激素受體的減少、內膜血流量的減少等，這些變化都可能使內膜容受性降低［21］。

總之，本研究表明，部分非優質胚胎有繼續發育的潛能，患者行非優質胚胎移植后可能成功妊娠。由于胚胎形態學觀察并不能完全客觀準確地反映胚胎的發育潛能，因此，在輔助生殖過程中，對于年齡較大、卵巢功能減退、獲得胚胎困難的患者，臨床工作者應謹慎對待，在沒有剩余胚胎的情況下，建議將其形態學評估為5B、4B 甚至更低質量的胚胎冷凍后移植，可以提高這些患者的累積妊娠率，改善臨床結局。

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