抗苗勒管激素與卵巢反應性及妊娠結局的相關研究

魏曉麗，周遠征，鄧成艷，何方方，郁琦，孫正怡，甄璟然

（1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100730 2.北京懷柔醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 101400）

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）過程中，控制性卵巢刺激（COH）方案及卵巢刺激藥物劑量的選擇是保證成功的重要環(huán)節(jié)，而評估卵巢的儲備功能、預測卵巢對藥物的反應性是至關重要的第一步。卵巢對外源性促性腺激素（Gn）反應差意味著藥物刺激卵巢后回收的卵母細胞數(shù)少，可供移植的胚胎數(shù)減少，從而影響妊娠率。抗苗勒管激素（AMH）僅由卵巢內的竇前及小竇卵泡的顆粒細胞分泌，AMH的血清水平與竇卵泡數(shù)量呈正相關［1］，并且參與竇卵泡的募集。測定AMH 水平可以相對真實地反映原始卵泡庫存情況，目前許多研究已證明AMH 可以更早、更準確的評估卵巢的儲備功能［2-4］。關于AMH 在IVF-ET 過程中預測卵巢反應性及妊娠結局方面并沒有統(tǒng)一觀點［1-2，5］。在COH 過程中的不同時間點檢測的AMH 水平能否更好地反應卵巢的反應性，以指導COH 過程中的用藥劑量，及能否預測妊娠結局，都是目前關注的問題。因此，本文就此做進一步的研究，以期能找到一些答案。

資料與方法

一、病例來源

選擇2009年3～9月期間因不孕癥就診于北京協(xié)和醫(yī)院生殖醫(yī)學中心的患者，共60 例。其中30例行短方案，30 例行長方案；平均年齡（31.92±5.02）歲（24～43歲），平均不育年限（4.3±3.4）年（1～17年）。

納入標準：3個月內未接受過促性腺激素治療；具有規(guī)律的月經(jīng)周期（24～35d）；基礎FSH＜11 U／L（包括以前出現(xiàn)過基礎FSH 水平升高但進入治療周期的FSH 正常）；雙側卵巢均存在；體重指數(shù)（BMI）18～25kg／m2；無多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥及子宮內膜異位癥，并排除全身其它系統(tǒng)疾病。

按不孕原因可分為：輸卵管因素38例（63.3%），男 方 因 素24 例（40.0%），不 明 原 因 不 孕1 例（1.67%），男方因素合并輸卵管因素6例（10.0%）。均經(jīng)子宮輸卵管碘油造影、腹腔鏡、男方精液檢查、睪丸或附睪穿刺證實。所有患者均知情同意。

二、實驗方法

1.基礎竇卵泡數(shù)（AFC）及激素水平檢測：采用超聲診斷儀頻率50HZ，于月經(jīng)第2～4天對所有參加研究的患者行消毒陰道超聲檢查。用二維超聲觀察雙側卵巢位置、形態(tài)、計數(shù)竇卵泡（直徑2～10mm 的卵泡）。留取60例患者月經(jīng)周期第2～4日、IVF周期注射Gn第5日及HCG 注射日清晨（大約8：00～9：00am）空腹靜脈全血4 ml（要求無溶血，非高脂血），2h內離心2 000～3 000r／min，離心10min，分離出血清后裝至0.5ml的EP管內，-20℃冰箱凍存待查。

血清 AMH 測定采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），其他激素測定采用電化學發(fā)光免疫法。記錄獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精卵數(shù)、卵裂數(shù)及優(yōu)質胚胎數(shù)。

2.控制性卵巢刺激（COH）：采用本中心常規(guī)短方案及長方案。根據(jù)患者的年齡、基礎FSH 值及AFC綜合評估，來決定具體采用何種方案。一般對于年齡較大，卵巢功能不太好及竇卵泡數(shù)較少者采用短方案。

短方案：即從月經(jīng)第2天開始皮下注射基因重組的FSH（果納芬，瑞士雪蘭諾），一般為300 U，qd，及促性腺激素釋放激素激動劑醋酸曲普瑞林（達必佳，德國輝凌）0.1 U，qd；用藥過程中根據(jù)卵泡的生長情況及激素（LH、E2）水平調整用藥，待卵泡成熟時，肌肉注射HCG 10 000U（麗珠制藥），約36h后取卵。取卵后實驗室常規(guī)受精或卵胞漿內單精子注射。受精后第1天觀察受精情況，第3天進行卵裂球胚胎評分，進行卵裂球移植。黃體期給予黃體酮支持，取卵后兩周測血清HCG，確定妊娠兩周后行陰道B 超，若宮腔可見妊娠囊則確定為臨床妊娠。

長方案：月經(jīng)周期第2～4 天開始服用避孕藥（OC）1＃qd×21d，在服用OC第18天時陰道超聲檢查無大卵泡則開始皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑醋酸曲普瑞林（達必佳）0.05Uqd或者0.1 U qd），達必佳一直用至HCG 日。待達必佳用到18 d時，即開始皮下注射基因重組的FSH 進行藥物刺激卵巢。之后過程均同以上短方案。

三、分組標準及檢測指標

1.卵巢反應性：根據(jù)獲卵數(shù)分為卵巢低反應組（獲卵數(shù)≤5 個）與正常組獲卵數(shù)＞5 個［6］，并根據(jù)Golan 1989年推薦標準確定卵巢過度刺激綜合征

（OHSS）。

2.臨床妊娠：取卵后兩周測血清HCG，確定妊娠兩周后根據(jù)超聲下是否見到妊娠囊診為臨床妊娠組與未妊娠組。

3.檢測指標：激素水平、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精卵數(shù)、卵裂數(shù)及優(yōu)質胚胎數(shù)。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、不同COH 方案患者一般情況

COH 方案中長、短方案各有30例。短方案患者與長方案患者相比，年齡、基礎FSH 值、AFC 均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；基礎LH、E2、不育年限及BMI均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表1）。

在短方案治療組中，有9 例患者曾出現(xiàn)基礎FSH 水平升高的情況，既往基礎FSH 為10.02～18.00U／L，平均值為（12.48±2.97）U／L，但進入治療周期的基礎FSH＜11U／L。

二、卵巢不同反應組間的一般資料及AMH 水平比較

1.不同的卵巢反應組的一般情況比較：卵巢低反應組6例，正常反應組49例，OHSS組5例。年齡、BMI、基礎FSH、E2組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；AFC、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精卵數(shù)、卵裂數(shù)及優(yōu)質胚胎數(shù)在組間均存在差異，低反應組＜正常反應組＜OHSS組，通過兩兩比較發(fā)現(xiàn)，除優(yōu)質胚胎在正常反應組及OHSS組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表2）。

表1 不同控制性卵巢刺激方案比較（±s）

表1 不同控制性卵巢刺激方案比較（±s）

注：與長方案組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 年齡（歲）不育年限（年）BMI（kg／m2）AFC（個）FSH（U／L）LH（U／L）E2（pmol／L）長方案 30 29.87±4.13 4.02±3.30 21.91±3.25 16.77±5.94 6.44±1.46 2.82±1.57 129.00±59.09短方案 30 33.97±5.05＊ 4.60±3.53 22.21±2.66 10.73±5.01＊ 8.06±2.38＊2.48±1.88 130.36±65.33

2.不同的卵巢反應組間各時間點的AMH 水平比較：根據(jù)卵巢反應性進行分組，基礎日、Gn第5日及HCG 日AMH 水平在不同反應組間存在差異，低反應組＜正常反應組＜OHSS組，通過兩兩組間比較發(fā)現(xiàn)，其差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。

三、COH 過程中AMH 及常用指標預測卵巢低反應性及OHSS的預測價值

1.預測卵巢反應性：以獲卵數(shù)≤5作為低反應性的判斷標準，將常用預測指標（年齡、基礎FSH、E2、AFC）和三個時間點的AMH 水平做ROC 曲線分析。具有預測價值的指標包括AFC以及基礎日、Gn第5日及HCG 日的AMH 水平（P＜0.05）；其中基礎日、Gn第5日及HCG 日的AMH 預測卵巢反應性的準確性最高，曲線下面積（AUC）-ROCAUC分別為0.923、0.932、0.934；緊隨其后的為AFCROCAUC0.877；年齡、基礎FSH、E2均未顯示出預測價值（P＞0.05）（表4、圖1）。

2.預測OHSS：以是否發(fā)生OHSS作為判斷標準，將常用預測指標（年齡、BMI、AFC）和三個時間點的AMH 水平做ROC 曲線分析。具有預測價值的指標包括AFC、基礎日、Gn第5日及HCG 日的AMH 水平（P＜0.05）；年齡及BMI未顯示出預測價值（P＞0.05）（表5、圖2）。

四、COH 過程中不同時間點的AMH 與獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精卵數(shù)等相關性分析

不同時間點的AMH 水平均與獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精卵數(shù)、卵裂數(shù)呈明顯正相關（P＜0.01）；不同時期的AMH 水平均與優(yōu)質胚胎數(shù)無統(tǒng)計學相關性（P＞0.05）（表6）。

五、AMH 與妊娠結局的相關性

60例患者共有29例于取卵后14d查出HCG陽性，其中27例（45%）達到臨床妊娠；其中短方案組的臨床妊娠率為33.3%（10／30），長方案的臨床妊娠率56.7%（17／30）。

根據(jù)是否達到臨床妊娠將60例患者分為妊娠組和未妊娠組。年齡在兩組中存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；基礎日、Gn第5日及HCG 日血清AMH水平在兩組間均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；基礎FSH 水平及AFC在妊娠組與未妊娠組均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表7）。

表2 不同的卵巢反應組間一般情況比較（±s）

表2 不同的卵巢反應組間一般情況比較（±s）

注：與正常反應組比較，＊P＜0.05；與低反應組比較，＃P＜0.05

組 別 病例數(shù) 年齡（歲）BMI（kg／m2）AFC（個）FSH（U／L）E2（pmol／L）低反應組 6 35.50±5.65 23.21±3.96 7.33±3.67＊7.25±2.73 130.58±76.23正常反應組 49 31.41±4.70 21.94±2.93 13.55±5.07 7.41±2.06 130.98±63.49 OHSS組 5 32.60±6.66 21.90±1.94 23.40±8.41＊＃ 5.65±1.64 115.79±19.71組 別 病例數(shù) 獲卵數(shù)（個）成熟卵數(shù)（個）受精卵數(shù)（個）卵裂數(shù)（個）優(yōu)質胚胎數(shù)（個）低反應組 6 4.17±1.17＊ 3.17±0.75＊ 2.67±0.82＊ 2.17±0.41＊ 0.67±0.52＊正常反應組 49 11.06±3.43 9.12±3.58 8.49±3.82 8.43±3.87 2.33±1.43 OHSS組 5 20.80±4.66＊＃ 19.4±4.34＊＃ 16.20±8.07＊＃ 15.20±6.76＊＃ 3.20±2.17＃

表3 不同卵巢反應組間AMH 水平比較（±s）

表3 不同卵巢反應組間AMH 水平比較（±s）

注：與正常反應組比較，＊P＜0.05；與低反應組比較，＃P＜0.05

組 別 病例數(shù) 基礎AMH（ng／ml） Gn第5日AMH（ng／ml） HCG 日AMH （ng／ml）低反應組 6 0.76±0.77＊ 0.42±0.41＊ 0.15±0.13＊正常反應組 49 3.45±2.51 2.69±1.93 1.29±1.09 OHSS組 5 8.30±4.29＊＃ 6.83±2.56＊＃ 2.64±1.20＊＃

表4 各預測指標對于預測卵巢反應性的敏感性比較

表5 各指標預測OHSS的敏感性比較

圖1 各觀測指標預測卵巢低反應性的ROC曲線

圖2 各觀測指標預測OHSS的ROC曲線

表6 AMH 與促排卵和受精結局相關分析

表7 妊娠組與未妊娠組各指標比較（±s）

表7 妊娠組與未妊娠組各指標比較（±s）

注：與妊娠組比較，＊P＜0.05

組 別 病例數(shù) 年齡（歲）基礎FSH 值（U／L）AFC（個）基礎AMH（ng／ml）Gn第5日AMH（ng／ml）HCG 日AMH（ng／ml）7 3.18±1.98 1.54±1.14未妊娠組 33 33.24±5.28＊ 7.33±2.25 14.81±5.13 3.49±3.50 2.51±2.58 1.妊娠組 27 30.30±4.37 7.19±2.05 12.88±6.98 3.69±2.3 09±1.15

討 論

一、AMH 與卵巢反應性及預測價值

在IVF 過程中，卵巢低反應的發(fā)生率約為10%［7］。我們的60例符合入組標準患者中，卵巢低反應性的發(fā)生率與目前的報道一致，為10%（6／60）。目前臨床上常用的評價卵巢儲備能力和在ART 中預測卵巢反應性的指標有年齡、基礎血清FSH、基礎LH、基礎E2、AFC等。

隨著年齡增長卵巢儲備逐漸降低，但其下降速度有明顯的個體差異。實際年齡并不等于卵巢生物年齡，女性年齡不能成為評價卵巢儲備的絕對指標。在我們的研究中就有兩名年齡分別為27及30歲的患者出現(xiàn)了低反應，可見，實際年齡并不一定能反應卵巢的真實年齡。該實驗的統(tǒng)計表明，低反應組的平均年齡較正常反應組大4歲，所以，兩組在年齡上是有差異的，即年齡越大，越容易出現(xiàn)低反應。但是統(tǒng)計結果并無顯著性差異，可能是由于我們兩組樣本量相差太大所致。

AFC是指在卵泡早期陰道超聲所觀測到的2～10mm的卵泡數(shù)量。目前認為AFC能很好地預測卵巢的反應性，且其預測價值要高于基礎FSH、E2等［8］。我們也發(fā)現(xiàn)，在低反應組的竇卵泡數(shù)明顯低于正常反應組，差異有統(tǒng)計學意義。由于AFC的測定對檢測醫(yī)生的經(jīng)驗有一定要求，并且結果易受醫(yī)生主觀因素的影響，在一定程度上降低了其預測的靈敏度。

Dolleman等［3］認為AMH 可以直接反應卵巢年齡，從而預測更年期的發(fā)生。Eman等［4］分析了早卵泡期、取卵日及黃體中期的AMH 水平與卵巢的反應性，結果也提示這三個階段的AMH 水平均可以反映卵巢的反應性，并且與獲卵數(shù)顯著相關。Tsepelidis等［9］對FSH＜10 U／L 行IVF 的患者觀察發(fā)現(xiàn)，在FSH 的水平尚未發(fā)生明顯改變時，用AMH 評估IVF周期中卵巢低反應的靈敏度、特異度分別達80%、85%，說明在預測卵巢反應時，AMH 比FSH 更靈敏。Arce等［5］認為AMH 與獲卵數(shù)明顯相關，且比FSH、inhibin B及AFC的相關性更高，能更好地預測卵巢低反應性（獲卵數(shù)≤3）及高反應性（獲卵數(shù)≥15）。我們研究的結果顯示：低反應組基礎日、Gn第5日及HCG日的血清AMH 水平均明顯低于正常反應組，而促性腺激素和雌激素均在正常水平。各時間點的AMH 與AFC、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精卵數(shù)、卵裂數(shù)呈顯著相關性，進一步提示AMH 可以很好地預測卵巢的反應性。因此，AMH 可以很好地預測卵巢反應性，且不受時間限制。也有研究認為Gn第5 天的AMH 水平可以更好地預測卵巢的反應性［10］。而我們的結果提示HCG日的AMH 水平在預測卵巢低反應性方面較其他指標敏感性更高，但三個時期的AMH 水平在預測卵巢低反應性方面其預測價值并無統(tǒng)計學差異。所以，分析認為在預測卵巢低反應方面，AMH 比其他指標更敏感，但各時期預測價值相當。而AMH 與優(yōu)質胚胎數(shù)之間并沒有存在明顯的相關性，分析原因可能是由于優(yōu)質胚胎數(shù)的影響因素很多，如卵母細胞質量、精子質量等，而AMH 是由顆粒細胞所產(chǎn)生，所以不能夠直接反映卵母細胞及胚胎的質量。

OHSS是IVF過程中最嚴重的并發(fā)癥。易發(fā)生OHSS并發(fā)癥的因素包括年齡＜35歲、竇卵泡數(shù)多或PCOS患者、HCG 日E2水平過高等。有研究表明發(fā)生OHSS的患者與高水平的AMH 水平相關，重度OHSS患者基礎AMH 血清水平是卵巢正常反應組婦女的6倍［11］。Lee等［12］對262個IVF周期觀察發(fā)現(xiàn)，用基礎AMH 水平來預測OHSS 的發(fā)生，其ROCAUC為0.902，Cut-off值取3.36ng／ml，其靈敏度、特異度分別可達90.5%、81.3%，比年齡和BMI更能預測OHSS的發(fā)生。我們觀察了60例行IVF的患者，其中5例發(fā)生OHSS（8.3%），其周期各時間點的AMH 水平均明顯高于正常反應組及低反應組，其中基礎AMH 平均水平達到（8.30±4.29）ng／ml，是正常反應組的2～3倍，提示血清AMH 水平也可作為預測OHSS的指標。同時從表5中我們觀察到HCG日的AMH 水平，較基礎日的預測價值更高。由于我們觀察到的陽性樣本數(shù)僅5例，所得結果僅供參考，還需進一步擴大樣本進行研究。

二、AMH 與IVF-ET 結局

目前認為在IVF周期中，年齡在預測妊娠結局方面具有明顯優(yōu)勢。我們的資料顯示，年齡在臨床妊娠組與未妊娠組存在差異，且具有統(tǒng)計學意義。而目前關于血清AMH 水平是否與妊娠結局相關一直存在爭議。Aboulghar等［13］研究表明正常水平AMH 組的妊娠率為42%，而低AMH 水平組的妊娠率僅為20%。Arce等［5］也認為血清AMH 與妊娠率正相關。也有文獻報道AMH 并不能預測IVF的妊娠結局［1-2，14］。我們的資料表明：各時間點的AMH 水平，均與臨床妊娠結局無關。分析原因可能是由于AMH 由顆粒細胞產(chǎn)生，所以不能夠直接反映卵母細胞和胚胎的質量。另外，胚胎種植率及妊娠率除與卵巢儲備功能有關外，還與胚胎質量、移植技術、子宮內膜容受性等其他很多因素有關。

Broer等［15］分 析 了 近10 年 來 的 文 獻，認 為AMH 是目前預測卵巢儲備功能最好的血清標記物。我們的研究提示了血清AMH 可作為評價卵巢反應性及卵巢儲備功能的血清學標記物，而且對于OHSS的發(fā)生也有預測作用。同時通過對三個時間點的AMH 值進行比較發(fā)現(xiàn)，HCG 日AMH 水平的預測價值最高，故在控制性超排卵治療過程中，可考慮通過檢測AMH 值來調整治療方案，若HCG 日的AMH 水平較高，可暫不進行移植，以避免OHSS的發(fā)生。但是目前關于AMH 是否能預測妊娠結局還需做進一步統(tǒng)計研究。如果希望得到更準確的預測卵巢反應性、卵巢過度刺激、卵巢老化的AMH 水平的臨界值，還有待更深入的研究。

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