偶氮染料與蛋白質相互作用的分子光譜法研究

張耀光

（吉林大學科教儀器廠，吉林 長春 130061）

熒光是一種光致發光現象，由于分子對光的選擇性吸收，不同波長的入射光便具有不同的激發效率。如果固定熒光的發射波長而不斷改變激發光的波長，并記錄相應的熒光強度，所得的熒光強度對激發波長的譜圖稱為熒光的激發光譜。如果使激發光的波長和強度保持不變，而不斷改變熒光的測定波長并記錄相應的熒光強度所得到的熒光強度對發射波長的譜圖則為熒光的發射光譜。激發光譜反映了在某一固定的發射波長下所測量的熒光強度對激發波長的依賴關系；發射光譜反映了在某一固定的激發波長下所測量熒光的波長分布。激發光譜和發射光譜可以鑒別熒光物質，并作為熒光測定時選擇合適的激發波長和測定波長的依據。熒光體發光首先要吸收光，即熒光體要有吸光的結構［1］。分子發光分析法具有如下特點：靈敏度高、選擇性比高、試樣量小、操作簡便、工作曲線的動態線性范圍寬。由于發光檢測的高靈敏度，以及發光光譜、發光強度、發光壽命等各種發光特性對研究體系的局部環境因素的敏感性，因此，發光分析法在光學分子傳感器以及在生物醫學、藥學和環境科學等方面的應用更顯示了它的優越性［2］。

紫外-可見分光光度法是分子吸收光譜法，涉及分子的價電子在不同分子軌道間能級的躍遷，對應的光譜范圍為200～800nm。紫外-可見吸收光譜包括紫外吸收光譜（200～400nm）和可見吸收光譜（400～800nm）。紫外-可見分光光度法主要用于分子的定量分析，但紫外光度法為四大波譜之一，是鑒定許多化合物，尤其是有機化合物的重要定性工具之一。隨著科學技術的發展，結合現代的光、電和計算機技術，紫外-可見分光光度法具有靈敏度高、準確度好、儀器價格低廉、操作簡便快速等優點，使紫外-可見分光光度法在有機化學、生物化學、藥品分析、食品檢驗、醫療衛生、環境保護、生命科學等各個領域和科研生產工作中成為一種重要的檢測手段［3］。當用熒光偏振光激發熒光分子時，熒光分子發射偏振光。這種偏振發射是由熒光分子對激發光子的取向引起的。實驗測得的熒光通常是消偏振的。其中最具有研究意義的是由于熒光分子在激發態壽命期間發生旋轉運動而引起發射消偏振。Perrin 早在1926年就報道過熒光偏振的原理，而Weber進一步拓展了熒光偏振的理論。熒光偏振測定已廣泛地應用于生命科學、臨床醫學、藥物分析和環境科學等領域。近年來，有不少關于熒光偏振的研究與應用的綜述發表。熒光偏振理論將熒光分子看成是一個振蕩偶極子（oscillating dipole），有內在的吸收偶極矩（absorption dipole moment）和發射偶極矩（emission dipole moment），也稱吸收躍遷矩（moment for absorption transi tion）和發射躍遷矩（moment for emission transition）。由于熒光分子的電子基態和電子激發態的電子分布不同，熒光分子的吸收偶極矩和發射偶極矩通常是不共線的。吸收偶極矩和發射偶極矩之間的夾角對每個熒光分子而言是由分子結構決定的。當用非偏振光激發熒光分子時，熒光分子優先吸收那些光子電矢量（E）與熒光分子的吸收偶極矩（M）平行的光子［4］。

蛋白質是生命的最基本物質之一，它與營養、發育、遺傳、新陳代謝等生命活動等密切相關，牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）在血漿中是含量較為豐富，是最重要的載體蛋白，具有存儲和轉運內源性和外源性代謝產物的重要生理功能。因為蛋白質中含有絡氨酸和色氨酸，所以它在紫外線照射下會發出紫外線熒光，因此可以進行熒光測定。蛋白質與某些熒光染料作用，有時會使染料的熒光強度增強，但有時也會使染料的熒光強度減弱，這些都視染料的自身性質而定，但均可用于蛋白質的檢測。并且由于其干擾少、快速、靈敏度高、準確、實用性高而發展很快，引起研究者的密切關注。

麗春紅S（Ponceau S）（又名猩紅S，酸性紅112）是一種帶負電荷，可以與帶正電荷的氨基酸殘基結合，在水中的溶解度為10 g/L的偶氮染料。

本文以牛血清白蛋白為血液中生物大分子的代表，在模擬生理條件下（pH=7），應用熒光偏振技術，采用熒光光譜法、紫外-可見分光光度法，研究麗春紅S 與牛血清白蛋白相互作用的光譜，對進一步探討麗春紅S 對蛋白質染色機理具有一定的意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-55熒光分光光度計（美國，PE公司）；UV-2550紫外分光光度計（日本島津，日本）；F-7000 熒光分光光度計（日本，日立公司）；電子天平：（AB135-S，Switzerland），100ul微量進樣器，移液管，10ml具塞刻度試管20支；BSA固體（Sigma），麗春紅S（上海撫生實業有限公司），磷酸二氫鈉，磷酸氫鉀，實驗用水均為三次水，所用試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 配置PBS緩沖溶液（pH=7.4 0.01M）

（1）用電子天平準確秤取0.0241g磷酸二氫鈉，0.2316g磷酸氫鉀，將其溶于水中，轉移到100ml容量瓶中，定容，搖勻。

（2）用PH試紙將其調至pH=7。

1.2.2 配置BSA母液（C=1mg/ml）

（1）用電子天平準確稱取25 mg BSA固體，將其溶于水中，轉移到25 ml棕色容量瓶中，定容，搖勻。

（2）取BSA 母液0.25ml 將其置于25ml 棕色容量瓶中，定容，搖勻。得到BSA溶液的濃度為10g/ml。（實驗所用BSA濃度均為10g/ml）。

1.2.3 配置工作液（麗春紅S）母液（C=1 mM）

（1）用電子天平準確稱取0.3800g麗春紅S固體，將其溶于水中，轉移到50ml棕色容量瓶中，定容，搖勻。

（2）取上述母液5ml將其置于50ml棕色容量瓶中，定容，搖勻。得到麗春紅S溶液的濃度為100M。

（3）取100M 的溶液0.5ml 將其置于50ml 棕色容量瓶中，定容，搖勻。得到麗春紅S溶液的濃度為1M。

1.2.4 配置一系列濃度梯度的樣品溶液

溶液濃度依次為1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1M、2M、5M、10M、20M、50M、100M。

1.3 熒光光譜的測定

1.3.1 確定最大Ex、Em的波長

（1）測BSA 的Ex、Em 光譜確定最大Ex、Em 的波長。（Ex=280nm，Em=349nm）

（2）以測BSA的參數測PBS的Ex、Em光譜。

（3）按濃度由低到高依次換上1.2.4中配置的BSA-染料溶液并測其Em光譜。

1.3.2 測定FP

（1）測定BSA的FP。

（2）按濃度由低到高測定1.2.4中配置的BSA-染料樣品的FP。

1.3.3 在紫外區測定麗春紅S的熒光強度。

1.4 紫外光譜的測定

配置一系列樣品溶液（0—3M）并稀釋至10ml；設置儀器參數，進行光譜掃描。

2 實驗結果與討論

2.1 最大Ex、Em波長的確定

實驗結果顯示，BSA的最大Ex=280nm、Em=349nm。

2.2 麗春紅S對牛血清白蛋白內源性熒光的猝滅

牛血清白蛋白分子中含有的氨基酸，如色氨酸（Tyr）、酪氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）殘基，能夠發射熒光，因而牛血清白蛋白是內源性熒光物質。由于牛血清白蛋白的內源熒光可能發生Tyr至Trp的轉移，當激發光波長為280nm 時，牛血清白蛋白熒光發射峰位置在349nm附近。隨著麗春紅S濃度增加，熒光峰強度有規律地降低，但在圖1 中熒光峰的位置沒有發生特別明顯的移動，說明麗春紅S 與牛血清白蛋白的相互作用沒有引起蛋白質空間結構的明顯改變，因此產生的是內源性熒光猝滅。

圖1 BSA+麗春紅S發射光譜

CBSA=10ug/ml、從上到下麗春紅S濃度依次為：1：0、2：1nM、3：5nM、4：20nM、5：50nM、6：100nM、7：200nM、8：500nM、9：1μM、10：2μM

2.3 麗春紅S的濃度與吸光度的關系

用紫外可見吸收光譜研究麗春紅S的濃度與吸光度的關系，分析發現，隨著麗春紅S 濃度的增加，吸光度值逐漸增加。在280nM左右的吸收峰是BSA的吸收峰。在350nM、530nM 左右的吸收峰是麗春紅S+BSA 的吸收峰。實驗中所用溶液濃度：麗春紅S+BSA 的濃度（3:0.2 M，4:0.5M，5:3M）；麗春紅S+PBS的濃度（系6:3M）1：PBS

2.4 麗春紅S 的濃度對熒光偏振強研究麗春紅S F0/F-C關系

實驗發現，隨著麗春紅S 的濃度的增加，F0/F 呈增強的趨勢。（F0是BSA的熒光強度，F是麗春紅S+BSA的熒光強度）。麗春紅S 濃度依次為：20nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1000nM、2000nM

得出關系式F0/F=0.0011C+1.1435

3 結論

（1）通過熒光光譜發現，一系列不同濃度的麗春紅S溶液，隨著麗春紅S 濃度的增加，熒光峰強度減弱，出現了熒光猝滅現象。說明麗春紅S能對牛血清白蛋白內源性熒光產生猝滅作用。實驗中若不加入BSA，只加入麗春紅S和PBS，不論是在可見光區還是在紫外區熒光強度均很小，說明麗春紅S自身的熒光強度很小。

（2）在紫外可見吸收光譜中隨著麗春紅S 濃度的增大，吸光度逐漸增強；當麗春紅S 濃度相同時，只有麗春紅S的吸光度值比麗春紅S+BSA的吸光度值大。

（3）當麗春紅S 的濃度在0-2000nM 范圍內，隨著麗春紅S的濃度的增加，其熒光偏振強度（F0/F）呈增強的趨勢。

［1］許金鉤，王尊本.熒光分析法［M］.北京:科學出版社，2006:7-8.

［2］分析化學下冊［M］.北京：高等教育出版社，2007:207.

［3］孫鳳霞，儀器分析［M］.北京:化學工業出版社，2004:13.

［4］許金鉤，王尊本.熒光分析法［M］.北京:科學出版社，2006：184-185.