HIV/HCV共感染者外周血輔助性T細胞17和IL-17A水平檢測*

丁佩佩，何　綱，陳曉華，甄沛林，吳興柳，胡長征

HIV/HCV共感染者外周血輔助性T細胞17和IL-17A水平檢測*

丁佩佩，何綱，陳曉華，甄沛林，吳興柳，胡長征

【摘要】目的探討HIV/HCV共感染者外周血輔助性T細胞17（Th17）及白細胞介素（IL）-17A的免疫調節作用。方法隨機選取HIV/HCV共感染者、HIV感染者、HCV感染者和健康人各30例，使用流式細胞儀檢測外周血CD4+T細胞數量和Th17數量，采用ELISA法檢測血清IL-17A水平。結果HIV感染者和HIV/HCV共感染者CD4+T淋巴細胞分別為（310.23±114.35）個/μl和（218.42±112.47）個/μl，均較健康人明顯降低［（735.46±121.52）個/μl，P＜0.05］，HIV/HCV共感染者較HIV感染者CD4+T淋巴細胞更低（P＜0.05），HCV感染者CD4+T淋巴細胞數為（719.47±123.72）個/μl，與健康人比較無顯著性差異；HIV感染者Th17百分比和IL-17A水平分別為（2.48± 0.90）%，和（25.18±12.63）pg/ml，均較健康人顯著降低［（3.95±1.23）%和（39.15±16.30）pg/ml，P＜0.05］，HCV感染者Th17百分比和IL-17A為（5.48±0.90）%和（45.24±15.72）pg/ml，顯著高于健康人（P＜0.05），而HIV/HCV共感染者Th17百分比為（1.76±0.42）%，IL-17A為（16.49±7.54）pg/mL，均顯著低于HIV感染者［（2.48±0.90）%和（25.18±12.63）pg/mL，P＜0.05］。結論合并HCV感染可能通過影響Th17及其細胞因子IL-17A進一步影響HIV患者的免疫功能。

【關鍵詞】丙型肝炎；艾滋病；T淋巴細胞；輔助性T細胞17；白細胞介素17A

HIV和HCV兩種病毒有著共同的傳播途徑，故兩者合并感染率高。據有關流行病學研究報告，我國靜脈吸毒人群HIV/HCV合并感染率高達69.0%～93.6%［1，2］。有研究者認為HCV的合并感染會加速HIV感染者的疾病進程［3，4］。也有研究者認為HIV感染能加速HCV RNA復制，加快疾病進展，增加患肝硬化和肝癌的風險［5］。HCV感染可引起復雜的病理過程，機體的輔助性T細胞及細胞毒性T細胞參與了抗病毒的免疫應答反應。HIV感染可以導致機體免疫功能失調，CD4+輔助性T細胞亞群減少，特異性細胞毒T細胞應答喪失。那么，在HCV/HIV合并感染的復雜狀態下，機體免疫功能失調會出現哪些變化？與HIV或HCV單純感染比較會有哪些不同？這些問題目前還不完全清楚，因而對其T淋巴細胞免疫調控機制的研究具有極其重要的意義。Th17細胞是近年來發現的新的CD4+T細胞亞群，能夠產生一系列的細胞因子，發揮重要的免疫調節作用，已成為一個重要的研究熱點。Th17細胞不但可以通過其分泌的細胞因子參與各種炎癥反應的發生，同時也可以與其他免疫細胞亞群之間相互作用，發揮負性免疫調節作用，將固有免疫與獲得性免疫有機地聯系起來。研究Th17及其細胞因子的變化對明確HIV/HCV共感染者的免疫調控有重要意義。本研究比較了HIV/HCV共感染者與HIV感染者、HCV感染者和健康人Th17細胞及其細胞因子水平的變化，以探討其在病毒混合感染發病中的作用。

1　資料與方法

1.1一般資料2012年1月至2014年3月我院就診的HIV/HCV共感染者30例，男18例，女12例；平均年齡（43.12±11.05）歲。HIV感染者30例，男20例，女10例；平均年齡（38.25±15.12）歲。HCV感染者30例，男21例，女9例；平均年齡（35.75±12.34）歲。以上3組患者均未接受抗病毒治療。HIV感染者符合2005年中國《艾滋病診療指南》的診斷標準［6］，排除合并機會性感染患者；HCV感染者符合2004年我國發布的《丙型肝炎防治指南》的診斷標準［7］，排除肝硬化患者；HIV/HCV共感染者同時符合HIV感染和HCV感染診斷標準，排除合并機會性感染患者及肝硬化患者。以上各組患者均排除高血壓、冠心病、糖尿病、惡性腫瘤等慢性疾病。各組患者年齡和性別差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。另選健康體檢者30例，男19例，女11例；平均年齡（40.12±13.05）歲。本研究在我院醫學倫理委員會備案，所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器RPMI 1640培養液、胎牛血清、淋巴細胞分離液均由美國Gibco公司提供；佛波酯（PMA）、離子霉素（ionomycin）購自美國Sigma Aldrich公司；莫能霉素（monensin）、抗人CD4 PE、抗人IL-17 APC-A購自美國eBioscience公司；抗CD45-CD3-CD4組合抗體和熒光微球購自美國Beckman公司；人白介素-17A（IL-17A）ELISA試劑盒由西唐科技生物有限公司提供；酶標儀（DENLEY DRAGON Wellscan MK 2）及洗板機（Wellwash 4 MK2）由芬蘭Thermo公司生產；流式細胞儀（MACS Quant SN2187）由德國Miltenyi公司生產。

1.3 CD4+T細胞檢測于清晨空腹采集肝素抗凝全血8 m1，2 h內用人淋巴細胞分離液分離血漿和外周血單個核細胞（PBMC）。血漿和PBMC置-80℃凍存。血漿用于檢測細胞因子，PBMC用于檢測Th17細胞。在各樣品反應管中加入EDTA抗凝全血100 μl，加入相應的抗CD45-CD3-CD4組合抗體10 μl，輕輕混勻。避光孵育20 min。用相配套溶血素A、B、C液溶血。加入熒光微球100 μl。以CD45陽性細胞設門，收集細胞，流式細胞儀分析CD3+CD4+雙陽性T淋巴細胞群。

1.4 Th17細胞檢測取上述PBMC，加入刺激劑佛波酯25 ng/ml，離子霉素1 μg/ml和蛋白質轉運抑制劑莫能霉素1.7 μg/ml，在37℃、5%CO2細胞培養箱培養4 h。收集細胞，根據計數等分為測定管和同型對照管。加入藻紅蛋白（PE）標記的鼠抗人CD8單抗20 μl、藻紅蛋白-青色素染料5（PE—Cy5）標記的鼠抗人CD3單抗10 μl，4℃避光孵育20 min。加固定液，室溫避光固定反應15 min，離心，棄上清，PBS洗滌2次。加入破膜劑，進行細胞打孔，以利于胞內細胞因子染色。在測定管中加入IL-17A-FITC，進行胞漿染色，在對照管中加入相應的同型對照，4℃避光孵育30 min。PBS洗滌2次，將細胞懸浮于PBS液0.5 ml中。在流式細胞儀上，根據CD3-SSC設門，分析CD8陰性細胞群，檢測Th17細胞。

1.5血清細胞因子檢測采用ELISA法檢測血清IL-17A水平。

1.6統計學處理應用SPSS l3.0軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗標準，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1各組人群外周血CD4+T淋巴細胞和Th17細胞計數的比較HIV感染者和HIV/HCV共感染者外周血CD4+T淋巴細胞均較健康人降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；HIV/HCV共感染者CD4+T淋巴細胞較HIV感染者更低，差異有統計學意義（P＜0.05）；HCV感染者CD4+T淋巴細胞與對照組比較無明顯差異（P＞0.05）；HIV感染者Th17百分比較健康對照組降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；HIV/HCV共感染者Th17百分比比HIV感染者更低，差異有統計學意義（P＜0.05）；HCV感染者Th17百分比較健康人升高，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1　4組人群外周血CD4+T淋巴細胞和Th17細胞計數（x±s）的比較

2.2血清IL-17A水平比較HIV感染者Th17型細胞因子IL-17A較健康人降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；HIV/HCV共感染者IL-17A比HIV感染者更低，差異有統計學意義（P＜0.05）；HCV感染者IL-17A較健康人升高，差異有統計學意義（P＜0.05，表2）。

表2　4組人群血清IL-17A水平（x±s）比較

3　討論

HIV感染是一個緩慢進展的長期免疫損傷過程。在急性感染階段，HIV大量復制，人體內CD4+T細胞被大量破壞，免疫系統顯著受損；在慢性無癥狀期，HIV與人體免疫系統達到一個相對平衡，但病毒的持續復制仍不斷摧毀免疫系統，體內CD4+T細胞不斷下降，最終導致免疫系統衰竭，出現各種機會性感染和腫瘤。因為存在共同的傳播途徑，HIV/HCV共感染情況在臨床較為常見。目前，世界上HIV與HCV共感染者約為四五百萬人［8］，在靜脈吸毒人群中，HIV合并感染HCV者高達90%［9］。由于兩種疾病的相互影響，HIV/HCV共感染者往往病情更復雜。HIV/HCV均可以損害人體的免疫細胞，對于兩者共感染情況的免疫功能變化研究對明確HIV/HCV共感染者的發病機制有重要意義。國內外均有研究發現，HIV/HCV共感染者CD4+T細胞水平較單純感染者更低［10～13］，但機制尚不清楚。我們研究的結果也證實了這一點，HIV感染者和HIV/HCV共感染者CD4+T細胞水平較健康人明顯降低，其中HIV/HCV共感染者CD4+T細胞水平比HIV感染者更低，但HCV感染者CD4+T細胞水平與健康人無明顯差異。由于CD4+T細胞水平與AIDS發病進程密切相關，故HIV/HCV共感染者較單純HIV感染者更容易進入發病期。HCV合并感染可能影響了HIV感染者的免疫功能，加速了HIV的發病過程。

Th17細胞是一種新的CD4+效應T細胞亞型，來源于Th0，具有與Th1、Th2不同的獨立分化途徑，具有強大的促炎作用［14］，它的發現不僅彌補了Th1/Th2細胞軸介導免疫效應的不足，而且完善了Th1/Th2免疫調節理論。Th17細胞參與體內炎癥反應，在各種炎性疾病和自身免疫性疾病中均有重要意義［15～18］。Th17主要通過分泌細胞因子，募集活化中性粒細胞，刺激上皮細胞，產生防御作用，介導炎癥反應。Th17細胞分泌的細胞因子主要包括IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 和TNF等，這些細胞因子具有動員、募集及活化中性粒細胞的功能［15］，而其中最重要的效應因子是IL-17。IL-17家族包括 IL-17 A～F共 6位成員，其中IL-17A能產生較強的致炎效應［16］。Thl7的反應很可能早于Thl或Th2型免疫反應，出現在感染的早期階段，誘發組織炎癥，并通過細胞因子的誘導，橋接先天免疫和適應性免疫，在炎癥后期吸引其他亞群的T細胞，向感染部位募集。有研究顯示，HIV感染者體內Th17明顯減少，而且其在HIV感染的早期就出現明顯降低［19］，但其發生機制尚不明確。也有研究發現，HCV感染者體內Th17有升高，其升高程度與干擾素的治療效果相關［20］。雖然目前對Thl7細胞與HIV/HCV的研究僅處于初步探索階段，但是相信隨著不斷的深人研究，其在免疫損傷機制中的作用將有可能被闡明。

我們的研究發現HIV感染者 Th17細胞及IL-17A水平均較健康人明顯降低，差異有統計學意義，說明HIV感染可能通過Th17細胞及其細胞因子IL-17A影響患者的免疫功能。相反，HCV感染者Th17細胞及IL-17A水平均較健康人明顯升高，差異有統計學意義，說明HCV感染也可引起Th17及其細胞因子的變化，此種變化為上調Th17細胞和IL-17A水平，也可影響患者的免疫功能。

那么，HIV和HCV的合并感染是否會對HIV感染者Th17細胞及IL-17A水平造成影響，從而進一步影響HIV感染者的免疫功能呢？目前國內外在這方面的研究比較少見。本研究發現HIV/HCV共感染者Th17細胞及IL-17A水平未如預期的那樣低，或許受到HCV的共同作用而使其處于兩組單純感染者的中間水平，反而是較HIV單純感染者更低，差異有統計學意義。故我們認為在HIV/HCV共感染者中，HCV的合并感染進一步加劇了患者Th17細胞及IL-17A水平的損害，并可能通過Th17通道進一步損害患者的免疫功能，最終加快HIV的發病過程。

我們的研究表明HCV合并感染可能通過影響Th17及其細胞因子IL-17A進一步損害HIV患者的細胞免疫功能。加強對Th17及其細胞因子IL-17A的研究將有助于進一步理解HIV/HCV共感染者的發病機制，為新的治療策略提供重要的研究方向。

【參考文獻】

［1］Zhou YH，Liu FL，Yao ZH，et a1.Comparison of HIV-，HBV-，HCV-andco-infectionprevalencebetweenChineseand Burmese intravenous drug users of the China-Myanmar border region.PloS One，2011，6（1）：e16349.

［2］Chen X，He JM，Ding LS，et a1.Prevalence of hepatitis B virus and hepatitis C virus in patients with human immunodeficiency virus infection in Central China.Arch Virol，2013，158（9）：1889-1894.

［3］Ladep NG，Agaba PA，Agbaji O，et al.Rates and impact of hepatitis on human immunodeficiency virus infection in a large African cohort.World J Gastroenterol，2013，19（10）:1602-1610.

［4］Raboud J，Anema A，Su D，et a1.Relationship of chronic hepatitis C infection to rates of AIDS-defining illnesses in a Canadian cohort of HIV seropositive individuals receiving highly active antiretroviral therapy.HIV Clin Trials，2012，13（2）：90-102.

［5］ DimitroulisD，SpartalisE，PikoulisE，etal.Hepatocellular carcinoma in patients co-infected with hepatitis C virus and human immunodeficiency virus.World J Hepatol，2013，5（6）: 323-327.

［6］中華醫學會感染病學分會艾滋病學組.艾滋病診療指南（2011版）.中華傳染病雜志，2011，29（10）：629-640.

［7］中華醫學會肝病學分會和傳染病與寄生蟲病學分會.丙型肝炎防治指南.中華肝臟病雜志，2004，12（4）:194-198.

［8］Lambotin M，Barth H，Moog C，et al.Challenges for HCV vaccine development in HIV-HCV co-infection.Expert Rev Vaccines，2012，11（7）:791-804.

［9］Deng LP，Gui XE，Zhang YX，et al.Impact of human immunodeficiency virus infection on the course of hepatitis C virus infection：a meta-analysis.World J Gastroenterol，2009，15（8）: 996-1003.

［10］Rauch A，Gaudieri S，Evison J，et al.Low current and nadir CD4+T-cell counts are associated with higher hepatitis C virus RNA levels in the Swiss HIV cohort study.Antivir Ther，2008，13（3）:455-460.

［11］何綱，譚雁冰，劉翠珍，等.HCV對中國HIV/HCV共感染者白細胞介素-7/白細胞介素-7受體的影響.實用醫學雜志，2014，30 （1）:64-66.

［12］Sajadi MM，Redfield RR，Talwani R.Altered T-cell subsets in HIV-1 natural viral suppressors（elite controllers）with hepatitis C infection.AIDS，2013，27（12）:1989-1992.

［13］Reiberger T，Ferlitsch A，Sieghart W，et al.HIV-HCV co-infected patients with low CD4+cell nadirs are at risk for faster fibrosis progression and portal hypertension.J Viral Hepat，2010，17（6）:400-409.

［14］Park H，Li Z，Yang XO，et al.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol，2005，6（11）:1133-1141.

［15］Sierro S，Romero P，Speiser DE.The CD4-like molecule LAG-3，biologyandtherapeuticapplications.ExpertOpinTher Targets，201l，15（1）：91-101.

［16］Zrioual S，Ecochard R，Toumadre A，et a1.Genome-wide comparison between IL-17A-and IL-17F-induced effects in humanrheumatoidarthritissynoviocytes.JImmunol，2009，182 （5）：3112-3120.

［17］Kumar A，Hilja K，Curt S，et al.Microscopic colitis patients demonstrate a mixed Th17/Tc17 and Th1/Tc1 mucosal cytokine profile.Mol Immunol，2013，5（3-4）:355-364.

［18］Kisand K，Wolff B，AS Podkrajsek K.Chronic mucocutaneous candidiasis in APECED or thymoma patients correlates with autoimmunity to Th17-associated cytokines.J Experiment Med，2010，207（2）:299-308.

［19］Prendergast A，Prado JG，Kang YH，et a1.HIV-l infection is characterized by profound depletion of CDl61+Th17 cells and gradual decline in regulatory T cells.AIDS，2010，24（4）：491-502.

［20］Lee HC，Sung SS，Krueger PD，et a1.Hepatitis C virus promotes T-helper（Th）17 responses through thymic stromal lymphopoietinproductionbyinfectedhepatocytes.Hepatology，2013，57（4）:1314-24.

（收稿：2014-07-07）（本文編輯：陳從新）

第一作者：丁佩佩，女，34歲，醫學碩士，副主任醫師。主要從事傳染病臨床與科研工作。E-mail：dingpeipei120@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.008

*基金項目：廣東省江門市科技計劃項目（編號：江科［2012］107-70）

作者單位：529030廣東省江門市中心醫院感染病科

Th17 cell counts in peripheral blood and serum IL-17A levels in HIV/HCV co-infected patients Ding Peipei，HeGang，ChenXiaohua，etal.DepartmentofInfectiousDiseases，JiangmenCentralHospital，Jiangmen 529030，Guangdong Province，China

【Abstract】Objective To explore the changes in Thl7 cell counts and serum IL-17A levels in HIV/HCV co-infected patients.Methods Thirty HIV/HCV co-infected patients，30 HIV infected patients，30 HCV infected patients and 30 healthy subjects were selected in this study.The percentage of CD4+T cells and Th17 cells in peripheral blood，and IL-17A in sera were detected by FCM and ELISA，respectively.Results The percentage of CD4+T cells in HIV and HIV/HCV co-infected patients were（310.23±114.35）/μl and（218.42±112.47）/μl，respectively，both were significantly lower than that in the healthy controls［（735.46±121.52）/μl，P＜0.05］，while the percentage of CD4+T cells in HIV/HCV co-infected group was even lower than in HIV infected patients（P＜0.05）；There was no significant difference in CD4+T cells between HCV infected patients［（719.47±123.72）/μl］ and the controls；The percentage of Th17 and serum level of IL-17A in HIV infected patients were（2.48±0.90）%and （25.18±12.63）pg/ml，significantly lower than those in the controls［（3.95±1.23）%and（39.15±16.30）pg/ml，P＜0.05］；The percentage of Th17 and serum level of IL-17A in HCV infected patients were（5.48±0.90）%and （45.24±15.72）pg/ml，significantly higher than those in the controls（P＜0.05）；The percentage of Th17 and serum level of IL-17A in HIV/HCV co-infected patients were（1.76±0.42）%and（16.49±7.54）pg/ml，both significantly lower than those in HIV infected patients［（2.48±0.90）%and（25.18±12.63）pg/mL，P＜0.05］.Conclusions Co-infection of HCV may influence the immune response in HIV infected patients，which might lead to the involvement of Th17 and IL-17A cytokine.

【Key words】Hepatitis C；Human immunodeficiency virus；T lymphocytes；T helper cell 17；Interleukin 17A