反義I型轉化生長因子β受體和反義TIMP-1聯合作用對大鼠肝纖維化的抑制作用

李紫瓊，木尼拉，高　峰

反義I型轉化生長因子β受體和反義TIMP-1聯合作用對大鼠肝纖維化的抑制作用

李紫瓊，木尼拉，高峰

【摘要】目的觀察轉化生長因子βI型受體（TβRI）反義RNA聯合TIMP-1反義RNA對實驗性肝纖維化的影響。方法構建TβRI和TIMP-1反義RNA真核細胞表達質粒，共同導入實驗性肝纖維化大鼠體內；應用免疫印記技術檢測實驗大鼠肝組織TIMP-1、TβRI和MMP-13蛋白表達水平。結果正常對照組、反義TβRI組、反義TIMP-1組、聯合治療組、空質粒組和模型組動物肝組織TIMP-1蛋白相對表達量分別為（23.6±2.8）、（57.96±3.8）、（62.3±2.8）、（34.2±2.8）、（279.2±29.8）和（287.3±23.7），TβRI蛋白的相對表達量分別為（56.2±2.7）、（70.5.±1.8）、（77.0±1.7）、（60.6±2.2）、（232.0±19.4）和（241.0±18.3），MMP-13蛋白相對表達量分別為（17.84±2.3）、（36.2±3.7）、（41.3±2.4）、（28.6±2.0），（127.3±1.2）和（118.5±2.5），與正常對照組及空質粒組比，反義TβRI組、聯合治療組和反義TIMP-1組TβRI、TIMP-1和MMP-13蛋白表達明顯減少（P＜0.05），但空質粒組與模型組比無顯著性差異。結論TβRI和TIMP-1反義RNA能有效抑制TβRI、TIMP-1和MMP-13蛋白表達，兩者聯合應用可產生疊加效應。

【關鍵詞】肝纖維化；反義RNA；質粒；轉化生長因子β；基質蛋白酶組織抑制因子

肝纖維化的形成主要是由于細胞外基質（ECM）降解減少，導致ECM沉積增多所致。在肝纖維化形成過程中，一般認為存在轉化生長因子-β（TGF-β）/Smad信號傳導通路，首先活化的TGF-β與II型TGF-β受體（TβRII）結合，并使之磷酸化而具有激酶活性；與TGF-β結合的TβRII再結合I型TGF-β受體（TβRI），形成I型和II型受體復合物，并使TβRI磷酸化，具有激酶活性；最后，激活的TβRI激活酶磷酸化其特殊的受體Smads（R-Smads），從而調節肝星狀細胞（HSC）的轉化和ECM的合成與降解。TβRI是唯一的直接將信號傳遞到細胞內的受體。ECM的降解受基質金屬蛋白酶-基質金屬蛋白酶抑制劑（MMPs-TIMPs）系統的調節，其中間質膠原酶（人MMP-1和鼠MMP-13）在降解纖維化肝臟ECM過程中起重要作用。本研究通過基因重組及反義技術，構建了反義TβRI和反義TIMP-1真核表達質粒，導入到實驗性肝纖維化大鼠體內，觀察它們對實驗性大鼠肝組織TβRI、TIMP-1和MMP-13蛋白表達的影響。

1　材料與方法

1.1動物與試劑正常純種系雌性SD大鼠（新疆醫科大學實驗動物中心提供），Trizol Reagent、質粒抽提試劑盒為美國Invitrogen公司產品。QIAGEN一步法RT-PCR試劑盒為德國QIAGEN公司產品。BCA蛋白定量試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶Xholl、EcoRI為美國Promega公司產品。JM-109大腸桿菌菌株（石河子大學醫學院生化實驗室惠贈）。抗TβRI單克隆抗體、抗 MMP-13單克隆抗體、抗TIMP-1單克隆抗體、抗β-actin均為美國R&D公司產品。堿性磷酸酶標記的鼠抗IgG等為碧云天生物科學技術研究所產品。

1.2反義 TβRI和反義TIMP-1質粒的構建與鑒定根據TβRI和TIMP-1 cDNA序列，設計PCR引物，由上海Sangon生物公司合成：取正常大鼠肝組織50 mg，提取總RNA。經瓊脂糖凝膠電泳，行RT-PCR獲得TβRI和TIMP-1cDNA基因片段，經PCR擴增、純化和回收。對基因片段應用雙切酶進行兩次雙酶切、線性化、純化后回收。應用T4 DNA連接酶分別將線形化的質粒與TβRI和TIMP-1基因片段定向及反向連接，構建以pcDNA31（+）為載體的反義TβRI和反義TIMP-1真核表達質粒。取陽性克隆，送上海生物工程公司測序分析，證實以pcDNA3.1（+）為載體的反義TβRI和反義TIMP-1真核表達質粒構建成功。

1.3實驗性肝纖維化大鼠模型制備及質粒的導入取雌性SD大鼠90只，體質量160～200 g。將大鼠隨機分為6組：即反義TβRI治療組、反義TβRI+反義TIMP-1治療組、反義TIMP-1治療組、pcDNA3.1（+）空質粒對照組、模型組和正常對照組，每組15只。采用尾靜脈注射CCl4、高脂食物混合喂養，其中肝纖維化大鼠在實驗過程中死亡1只。通過病理組織學觀察，制備大鼠肝纖維化模型成功。各實驗組大鼠體內分別導入相應的質粒治療，正常對照大鼠同時給予生理鹽水500 mL腹腔注射。所用質粒在注射前按比例與Lipofectmine2000混勻，經腹腔定期注射至實驗大鼠腹腔內，至第8周末處死動物，取實驗大鼠肝組織50 mg進行下一步實驗，對部分大鼠肝組織行病理學檢查。

1.4肝組織TIMP-1、TβRI和MMP-13蛋白表達的檢測采用Western bloting法。取大鼠肝組織50 mg，按照蛋白提取試劑盒說明書操作，提取總蛋白。應用BCA蛋白定量試劑盒定量。加入蛋白質60 μg，使用10%聚丙烯酰胺凝膠在電泳儀上電泳，分離蛋白。將分離后的蛋白通過電轉膜儀，電轉移至PVDF膜。分別用封閉液封閉PVDF膜，分別加抗TIMP-1單克隆抗體、抗TβRI單克隆抗體、抗MMP-13單克隆抗體和抗β-actin孵育，再加二抗孵育。應用發光試劑盒對轉移在PVDF膜上的蛋白進行曝光，洗片，照相，應用Quantity one凝膠成像分析，對膠片進行照相，計算每個條帶的光密度值，用 TIMP-1/β-actin、TβRI/β-actin、MMP-13/β-actin光密度比值表示TIMP-1、TβRI和MMP-13蛋白的相對表達水平。

1.5統計學處理計量資料以（x±s）表示，應用SPSS17.0統計軟件行方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠肝組織TIMP-1、TβRI和MMP-13蛋白相對表達量的比較見表1和圖1～3。結果顯示，與空質粒組和模型組相比，反義TIMP治療組TβRI蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），反義TIMP-1治療組肝組織TIMP-1和MMP-13蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；與空質粒組和模型組比，反義TβRI+反義TIMP治療組肝組織TβRI、TIMP-1和MMP-13蛋白表達量顯著降低（P＜0.01）；肝纖維化模型組與空質粒組比，三

表1　各組大鼠肝組織TIMP-1、TβRI和MMP-13蛋白表達水平（x±s）

種蛋白表達的差異無顯著性統計學意義（P＞0.05）。

圖1　各組大鼠肝組織MMP-13蛋白的表達

A：空質粒；B：肝纖維化；C：反義TβRI治療；D：反義TIMP-1治療；E：反義TβRI+反義TIMP-1治療；N：正常對照組

圖2　各組大鼠肝組織TβRI蛋白的表達

A：空質粒；B：肝纖維化；C：反義TβRI治療；D：反義TIMP-1治療；E：反義TβRI+反義TIMP-1治療；N：正常對照組

圖3　各組大鼠肝組織TIMP-1蛋白的表達

A：空質粒；B：肝纖維化；C：反義TβRI治療；D：反義TIMP-1治療；E：反義TβRI+反義TIMP-1治療；N：正常對照組

3　討論

肝纖維化的主要病理生理特征是肝內細胞外基質的生成和降解的失衡，調節這一平衡的主要系統是基質金屬蛋白酶-基質金屬蛋白酶抑制因子系統及TGF-β信號傳導通路。在肝纖維化形成過程中，肝實質細胞和非實質細胞都會分泌釋放大量的TGF-β，可明顯激活HSC轉化為成纖維細胞，大量合成ECM，對肝纖維化的發生，發展起著重要作用［1～6］。目前，人們公認在肝組織受到損傷因子的作用后，TGF-β的大量活化和釋放是機體損傷修復的重要過程［7］。在正常情況下，TGF-β的這一生物學功能對機體具有積極的意義，當TGF-β超過正常表達時，它可以使組織修復過程變成慢性過程，最終導致組織器官發生纖維化、硬化、結構破壞、功能喪失。如果選擇性地調節和阻斷TGF-β的功能，對肝纖維化逆轉有著積極的意義。

在肝纖維化形成過程中，MMP-13活性受到其特異性抑制劑TIMP-1的調節。關于MMP-13在整個肝纖維化發生過程中的動態變化規律，國內外的研究結論不一。聶青和等人研究發現TIMP-1可以與MMP-1 和MMP-3結合，并抑制其活性，TIMP-1表達增強可促進纖維化的肝臟間質膠原的沉積，且肝纖維化的程度變得嚴重，因而認為它是肝纖維化發生過程中一個非常重要的促發因素［8］。國外Kossakowska et al［9］認為在大鼠肝纖維化形成過程中TIMP-1表達持續增高，但MMP-13表達水平幾乎保持不變。Okazaki et al［10］認為，MMP-13表達在大鼠肝纖維化發生過程中有一短時輕度增高的過程，然后在肝纖維化逆轉的早期也有一短時明顯增高過程，在其它時段沒有什么變化。朱躍科等［11］研究了肝纖維化過程中基質金屬蛋白酶及其抑制因子表達的動態變化及相互關系顯示，在大鼠肝組織受到二甲基亞硝胺損傷后數天，TIMP-1即先于MMP-13表達增高，表明在肝纖維化發生初期，膠原的降解即受到抑制，有利于膠原的沉積；在肝纖維化的發展階段，雖然MMP-13的表達明顯增高，但由于TIMP-1也處于明顯增高的水平，這個階段MMP-13活性依然相對受到抑制，沉積的膠原得不到有效降解；在實驗后期，即進入肝纖維化晚期或早期肝硬化階段，MMP-13表達明顯降低，而TIMP-I表達仍持續增高，MMP-13降解膠原的能力絕對受到抑制，加上膠原的表達與沉積不斷增多，最終促成肝纖維化乃至肝硬化的形成。

本研究應用CCL4混合法成功制備大鼠肝纖維化模型。成功構建反義TβRI及反義TIMP-1真核細胞表達質粒，導入實驗性肝纖維化大鼠體內，反義TβRI及反義TIMP-1真核細胞表達質粒能在大鼠體內有效表達。實驗發現，肝纖維化大鼠在導入反義TβRI及反義 TIMP-1真核表達質粒后，發現TIMP-1、TβRI、MMP-13蛋白表達量明顯下降，故可認為兩種反義質粒有效地抑制了相應蛋白的表達，證實質粒導入成功，作用可靠。當兩種反義質粒同時使用時可使TβRI蛋白、TIMP-1蛋白、MMP-13蛋白表達量顯著降低，可能與TGF-β和TIMP-1兩種細胞因子之間存在相互影響有關。

楊長青等［12］在免疫誘導的肝纖維化大鼠體內導入通過基因重組技術構建的大鼠MMP-1和反義TIMP-1真核細胞表達質粒，試圖通過單純阻斷某一個信號傳導通路來阻斷肝纖維化的發生和發展。結果發現肝纖維化程度在一定程度上得到了逆轉。Knittel T et al［13］研究發現在四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠，在肝纖維化明顯時僅能檢測到低水平的MMP-13 mRNA，在肝纖維化恢復期MMP-13 mRNA水平又顯著增加。我們的實驗結果與上述結果不完全一致，可能原因是致肝纖維化模型的原因及恢復時的外因不同，而測定MMP-13表達的時期不同也是另外一個可能的原因［14］。

我們研究結果表明，反義TβRI及反義TIMP-1真核表達質粒能夠在一定程度上逆轉實驗性肝纖維化。兩者聯合作用可產生疊加效應。反義TIMP-1真核細胞表達質粒能夠在分子水平封閉肝臟內源性TIMP-1表達，從而促進間質膠原酶MMP-13活性，在一定程度上使實驗性肝纖維化得以逆轉［15，16］。反義TβRI能在一定程度上經TGF-β信號傳導通路阻斷實驗性肝纖維化的發展［17］。國內有一些應用中藥逆轉肝纖維化的報道，但具體機制不清［18～20］。本研究從分子水平研究，發現反義TβRI及反義TIMP-1真核表達質粒可在一定程度逆轉實驗性肝纖維化，為臨床抗肝纖維化的基因治療奠定了基礎。

肝纖維化是一個復雜的多因素作用過程，各種細胞因子間的相互協調以及細胞因子與其他因素間的相互作用形成了復雜的細胞因子網絡，并共同影響相應的靶細胞。在正常狀態下，肝臟細胞因子網絡處于一種平衡狀態，在各種損傷因素的作用下，這些因子一旦失衡，正向調解肝纖維化的細胞因子就會產生瀑布效應，導致ECM的過度沉積而形成肝纖維化［1］。因此，在肝纖維化的防治過程中，單用一種細胞因子或用一種細胞因子抗體或其受體拮抗劑均不能有效地阻止疾病的發展過程，而對細胞因子網絡的整體調整使其構成和所產生的生物學效應趨于正常化或同時采用消除病因等綜合措施，才有可能取得較好的治療效果。

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（收稿：2014-05-16）（本文編輯：陳從新）

第一作者：李紫瓊，男，37歲，醫學碩士，主治醫師。主要從事肝纖維化研究。E-mail：liazi2006@126.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.017

作者單位：830000烏魯木齊市新疆維吾爾自治區人民醫院消化內科

Inhibiting effects of antisense transforming growth factor β type I receptor and antisense TIMP-1 on experimental hepatic fibrosis in ratsLi Ziqiong，Mu Nila，Gao Feng.Department of Gastroenterology，People's Hospital，Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumchi 830000，Xin Jiang Uygur Autonomous Region，China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of transforming growth factor β type I receptor（TβRI）antisense RNA and tissue inhibitor of metalloproteinase 1（TIMP-1）antisense RNA on experimental liver fibrosis in rats.Methods TβRI and TIMP-1 antisense RNA eukaryotic expression plasmids were constructed and transfected into experimental rats with hepatic fibrosis.The impacts of TβRI and TIMP-1 antisense RNA on TIMP-1，TβRI and MMP-13 expression were detected by Western blot.Results The relative expressions of TIMP-1 protein in normal control group，antisense TβRI group，antisense TIMP-1 group，combinational group，plasmid group and model group were（23.6±2.8），（57.96±3.8），（62.3±2.8），（34.2±2.8），（279.2±29.8）and（287.3±23.7），respectively；the relative expressions of TβRI in each groups were（56.2±2.7），（70.5.±1.8），（77.0±1.7），（60.6±2.2），（232.0±19.4）and（241.0±18.3），respectively；and the relative expressions of MMP-13 were（17.84±2.3），（36.2±3.7），（41.3±2.4），（28.6±2.0），（127.3±1.2）and（118.5±2.5），respectively.The relative expressions of TβRI，TIMP-1 and MMP-13 in antisense TβRI group，antisense TIMP-1 group and combinational group were significantly decreased compared with normal control group and plasmid group（P＜0.05），while there was no significantly differences between plasmid and model group.Conclusions Antisense TβRI RNA and antisense TIMP-1 RNA can both inhibit the expressions of TβRI，TIMP-1 and MMP-13 protein effectively，and their combination can improve the inhibiting effects.

【Key words】Liver fibrosis；Antisense RNA；Plasmids；Transforming growth factor β receptor；Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases