一株牛瘤胃耐酸纖維素降解細菌的篩選、鑒定及酶學(xué)特性分析

馬寧++魏姜勉++張亮

摘 要：通過對夏南牛瘤胃樣本進行微生物富集培養(yǎng)，篩選、獲得一株纖維素高效降解細菌ZJ08，分子鑒定確定該菌屬于假黃單胞菌屬，其纖維素酶活的最適溫度為55℃，最適pH為5.0，是一株具有較強耐酸特性的纖維素降解菌株，具有潛在的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：假黃單胞菌；牛瘤胃；微晶纖維素；降解

中圖分類號： 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2015）06-0007-02

反芻動物的瘤胃消化系統(tǒng)是一個小型的“纖維素降解發(fā)酵系統(tǒng)”，瘤胃中棲息著大量微生物，其中部分真菌和細菌可以分泌纖維素酶以輔助消化并吸收富含纖維素的飼料。因而瘤胃中纖維素降解微生物在新飼料研發(fā)、新能源開發(fā)及環(huán)境治理等方面有著潛在的應(yīng)用價值。本研究從夏南牛瘤胃中分離到1株能夠利用微晶纖維素的微生物，對其進行了鑒定和酶學(xué)特性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 微晶纖維素購自上海生工生物有限公司，CMC購自國藥集團化學(xué)試劑公司。剛果紅、（NH4）2SO4、 K2HPO4、 NaH2PO4、 MgSO4·7H2O、 NaCl、 NH4H2PO4、KCl、 蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏等購自國內(nèi)各生物試劑公司。引物EU8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和EU1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）由上海Sangon公司合成。DNA聚合酶、T4 Ligase、pMD-18T Vector購自TaKaRa大連公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基參照《分子克隆實驗指南》中的配方。SX固體培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 2.5 g，K2HPO4 2.0 g，NaH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，微晶纖維素 5.0 g，瓊脂 15.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.4。

1.1.3 菌種 供試菌ZJ01至ZJ34等34個菌株由駐馬店市獸藥飼料（動物產(chǎn)品）質(zhì)量檢驗監(jiān)測中心提供。將-40℃保存的34個供試菌株在SX培養(yǎng)基中劃線，置于28℃恒溫培養(yǎng)活化。

1.2 方法

1.2.1 剛果紅染色法 將待測菌株接種于SX固體培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)6 d后，用0.1%的剛果紅溶液浸泡平板10 min，用0.85%的 NaCl水溶液漂洗15 min，觀察平板上是否出現(xiàn)透明降解圈，以驗證纖維素是否被有效降解。

1.2.2 菌種發(fā)酵及pH變化檢測 用打孔器挑取經(jīng)28 ℃活化培養(yǎng)5d的菌體5塊，置于150 mL的SX液體培養(yǎng)基中，100 r/min，28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)，每隔24 h取5 mL上發(fā)酵液，10 000 r/min離心3 min后取上清液，計測定發(fā)酵液pH值，每個樣品重復(fù)3次。

1.2.3 基因組DNA提取 挑取目標菌株單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，120 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)過夜；5 000 r/min離心10 min收集沉淀，用0.85 % NaCl沖洗2次；將沉淀懸浮于0.5 mL 0.85% NaCl溶液中，每管加入0.4 μL100 mg/mL溶菌酶，37 ℃振蕩1 h；加入40 μL 10% SDS水溶液，再加入25 μL 100 mg/mL的蛋白激酶K，37 ℃下震蕩3～4 h，待溶液完全透明后，置于60 ℃下處理20 min，使蛋白酶失活；每管加入一倍體積的酚-氯仿，輕輕混勻，使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀析出；15 ℃，5 000 r/min離心15 min。取上層液體移入1.5 mL離心管中，向管中加入1/10體積3 mol/L CH3COONa；緩慢加入2.5倍體積-20 ℃下預(yù)處理的無水乙醇，混勻后置于-80℃冰箱中冷凍30 min，取出后在4 ℃下12 000 r/min離心15 min；棄上清，向管中加入0.5 mL 的-20℃的70%乙醇溶液，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，棄上清后于超凈工作臺中過夜干燥，加入適量的ddH2O 使DNA溶解，將DNA 置于-20℃冰箱中保存待用。

1.2.4 菌株16S rDNA擴增與測序 用原核生物通用引物EU8F和EU1492 R進行PCR擴增。PCR 反應(yīng)體系總體積25 μL，擴增條件為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測及凝膠回收試劑盒純化，克隆到pMD 18-T Vector，送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.5 CMCase 酶活力的測定 取培養(yǎng)6 d的CM液體發(fā)酵液，5 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液用于酶活測定。具體方法如下：吸取粗酶液0.2 mL，加入1.8 mL 1% （W/V）CMC-Na 的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.8），經(jīng)50 ℃恒溫水浴30 min 后， 按DNS法在540 nm下測定吸光值，換算還原糖生成量， 計算CMC 酶活。分別在不同溫度、不同pH下測定CMC酶活。在酶反應(yīng)體系中分別加入0.01 mol/L 的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Hg2+ 和Pb2+等金屬離子，測定其對纖維素酶活力的影響。

酶活單位按照國際單位規(guī)定定義為以每分鐘催化纖維素水解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U）。CMC酶活（U）=A×5×25×1000/30（μmol/mL·min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌株的篩選

將34株供試菌活化后接種至SX固體培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)8 d，篩選出生長作為旺盛的ZJ08菌作為目標菌株，并對其進行剛果紅染色，出現(xiàn)一個明顯的無色透明圈。剛果紅與纖維素等多糖結(jié)合形成剛果紅-多糖復(fù)合物呈現(xiàn)紅色，當多糖物質(zhì)被降解后，剛果紅則與之分離而脫色。

2.2 菌株發(fā)酵液pH值變化

將ZJ08菌接種于SX液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，120 r/min下恒溫培養(yǎng)，每24 h取樣測定pH值。第三天，發(fā)酵液pH值開始迅速下降，第六天時pH降至2.30，隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)增加，pH值開始回升。

2.3 菌株的分子鑒定

用原核生物通用引物EU8F和EU1492R對ZJ08菌株基因組DNA進行擴增、克隆并測序。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，選取同源性較高的菌株，使用Mega 5.0軟件的MCL（Maximum Composite Likelihood）法計算進化距離，用NJ（Neighbor-Joining）法和Bootstrap法產(chǎn)生1 000個聚類樹，按照多數(shù)規(guī)則法（Majority-rule）得到了一個最“逼真”的系統(tǒng)發(fā)育樹。ZJ08菌株屬于假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas sp.），與對芳香烴物質(zhì)間苯二酚具有較強降解能力的QQDP512菌株的同源性高達99%，與對有機殺菌劑百菌清具有很好降解能力的CTN-8菌株的同源性達99%。

2.4 酶學(xué)特性

2.4.1 酶的最適反應(yīng)條件 在30～80 ℃范圍內(nèi)，分別測定不同溫度下的酶活力。結(jié)果表明，ZJ08菌株的酶活力在45～65 ℃范圍內(nèi)均能保持較高水平的酶活，在55 ℃下酶活力最高，達到96.4 U/mL。

ZJ08粗酶液只在初始pH 4.0～6.0范圍內(nèi)具有較高活性，當pH值高于8.0或低于3.0，相對酶活僅有不到20%。

ZJ08菌株的酶活跟反應(yīng)體系中的金屬離子種類有直接聯(lián)系。在Fe2+和Mn2+的作用下，相對酶活均提高100%以上；而Pb2+ 、Hg+、和Cu2+等重金屬均可使酶活降低80%以上，對酶蛋白有強烈的抑制作用。

2.4.2 酶活熱穩(wěn)定性分析 將粗酶液分別置于55～85 ℃的溫度范圍內(nèi)水浴處理30 min，于55℃下測定相對酶活，從而進行熱穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明，當粗酶液于65～85 ℃高溫處理30 min后，殘留活力迅速下降至40%以下；60 ℃處理30 min后，酶活力下降至53%； 55 ℃處理30 min后，酶活力仍為100%。

3 討論

本研究選用微晶纖維素為單一碳源，對從牛瘤胃中分離出34種微生物進行分離篩選，并獲得一株纖維素高效降解菌ZJ08，通過分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株屬于假黃單胞菌屬。這也是首次證明假黃單胞菌屬菌株具有纖維素的能力。此外，該屬的部分菌株對于一些復(fù)雜的有機化合物（如百菌清、間苯二酚）具有較好的降解作用，這從一定程度上說明了假黃單胞菌屬對一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機化合物有獨特的降解能力。

ZJ08菌株具有較強的纖維素降解能力和獨特的產(chǎn)酸特性，在畜禽飼料、化工原料生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)保領(lǐng)域有著較高的利用前景。

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