均勻設計法優化人類SMN基因PCR擴增

高春艷

摘要：采用均勻設計法，對影響PCR的主要因素，即退火溫度、引物、Taq酶、二甲基亞砜（DMSO）、模板DNA進行了優化，得到人類SMN基因的最優PCR擴增體系。結果表明，PCR擴增條件和反應體系的最優組合為：退火溫度61.6 ℃、Taq酶0.26 μL、引物（10 μmol/L）3.6 μL、DMSO（100%） 2 μL、DNA 3.8 μL。

關鍵詞：DNA；鹽析法；均勻設計法；灰度分析；PCR擴增

中圖分類號：Q781 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-3031-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.061

Optimizing the PCR Amplification of Human SMN Gene by Uniform Design Method

GAO Chun-yan1a，1b，LI Jun1a，1b，CAI Lu1a，1b，2

（1a.The Institute of Bioengineering and Technology；1b.School of Mathematics Physics and Biological Engineering，

Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010， Inner Mongolia， China；

2.Inner Mongolia Key Laboratory of Biomass-Energy Conversion， Baotou 014010， Inner Mongolia， China）

Abstract： Based on uniform design method， the critical factors implicating with PCR， such as annealing temperature， primer，Taq polymerase，DMSO，DNA，were optimized respectively and PCR amplifying condition of human SMN gene was established. The results shouwed that annealing temperature 61.6 ℃，Taq polymerase 0.26 μL， primer（10 μmol/L）3.6 μL，DMSO（100%）2 μL，DNA3.8 μL were designated to the optimized combination between PCR amplifying condition and reaction system.

Key words： DNA； salting out method； uniform design； gray analysis； PCR amplification

人類SMN基因位于染色體5q13上，全長約20 kb，含9個外顯子，該染色體上有兩個高度同源的拷貝，端粒側拷貝（SMN1或SMNt）和著絲粒側拷貝（SMN2或SMNc）。SMN1和SMN2在序列上高度相似，兩者之間的DNA序列僅存在5個堿基的差異，其中SMN2基因外顯子7（+6C→T）的堿基置換直接影響了基因的可變剪接模式，因此對SMN基因的研究具有重大的現實意義。人類SMN基因片段為高GC含量，富含GC堿基的DNA的PCR難點在于模板DNA形成的二級結構使DNA模板比較難變性[6]；退火時引物與模板不能很好地結合，容易形成錯配；延伸過程也不能很好進行，從而使擴增效率大大降低；普通的PCR擴增1.5 kb以上的長片段基因經常會遇到困難[7]。均勻設計法[8，9]將試驗有關因素的各水平數均勻分散在試驗范圍內，使每一個試驗點具有更好的代表性，減少了試驗次數，而且試驗結果可用計算機處理，在尋找最佳試驗條件、最佳配比等方面是選擇優化條件的有力工具。本研究采用均勻設計法對PCR主要因素：退火溫度、引物、Taq酶、DMSO（二甲基亞砜）、DNA等5個因素進行優化試驗，從而得到適合于人類基因SMN基因片段的PCR擴增條件和反應體系的獲得最優組合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 人類外周血標本取自包頭醫學院第一附屬醫院；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物P1：5′-CGACGACAAGACCGTGAATGAAAAT GAAAGCCAAGT-3′，下游引物P2：5′-GAGGAGAAGAGCCGTGATAGTACGACCGA CGGA-3′；Taq酶、dNTPs、DMSO購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 儀器 NanoDrop紫外分光光度計，G16-W型微量高速離心機，Eppendorf高速冷凍離心機，Biometra PCR擴增儀，TGL-16C型臺式離心機，GeneGenius凝膠成像儀。

1.2 方法

1.2.1 鹽析法從人類外周血中提取人類全基因組DNA 取500 μL血樣，置于1.5 mL EP管中，加入1 000 μL 0.9%的NaCl，搖勻后靜置5 min，10 000 r/min離心20 min；棄上清，加入1 000 μL紅細胞裂解液，充分顛混均勻至清亮，然后10 000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀中加入1 500 μL紅細胞裂解液，充分振蕩后12 000 r/min離心10 min；徹底棄上清，加入白細胞裂解液500 μL（裂解細胞）渦旋混勻；再加入150 μL的飽和NaCl渦旋混勻，靜置15 min后12 000 r/min離心15 min；取上清置于另一EP管中，加預冷的無水乙醇至1.5 mL，輕輕搖勻后，有白色絮狀物（DNA）析出，用移液槍將溶液吸出，將絮狀物留在EP管中；用移液槍吸取500 μL的75% 乙醇輕輕沖洗EP管中的DNA，加入50 μL 1×TE Buffer，使DNA溶解，將溶液狀態的DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 均勻設計法優化PCR擴增條件 在確定的反應程序下研究退火溫度、Taq酶、引物（10 μmol/L）、DMSO、DNA濃度5個因素對SMN基因片段擴增結果的影響（反應體系中其他因子為定量）。根據均勻設計法的要求，將每個因素分成10個水平根據均勻設計進行試驗，組合見表1。

1.2.3 PCR產物灰度分析 按均勻設計法優化PCR擴增條件（表1），得到的PCR產物進行0.8%瓊脂凝膠電泳后，并用Quantity one 4.6.2進行灰度分析。

2 結果與分析

2.1 鹽析法DNA提取結果

由圖1可以看出，鹽析法提取的DNA在瓊脂糖凝膠電泳上條帶清晰整齊，具有較好的完整性。

2.2 優化前的PCR擴增結果

由圖2可以看出，優化前的PCR擴增產物的凝膠成像圖可見條帶不是很清晰，說明優化前的PCR擴增效果不好，需要進行進一步優化。

2.3 均勻設計法優化PCR擴增結果

將提取的DNA中濃度最好的作為DNA樣品，并按照表1中的條件進行PCR擴增，其產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像結果如圖3。根據表1中PCR擴增具體條件進行PCR擴增，與圖2相比圖3的擴增產物的凝膠成像圖條帶明顯清亮、齊整，充分說明均勻設計法優化PCR擴增效果明顯。

以泳帶灰度值作為指標，用均勻設計軟件對PCR擴增條件再次進行優化，得出最終優化條件，結果見表2。

根據表2均勻設計軟件的優化結果建立PCR體系，進行PCR擴增，作6個平行管，對其產物進行凝膠電泳，結果如圖4。

用均勻設計軟件最終優化出的PCR條件進行擴增后的產物的灰度高，達到了預期的效果，說明均勻設計法最終優化出的PCR擴增條件為最優擴增條件。

3 小結與討論

PCR擴增是基因研究的關鍵步驟，雖然PCR擴增操作是簡單的，但其影響因素較多，擴增效果很難把握。普通PCR擴增1.5 kb以上的長片段基因經常會遇到困難，如果未找到最佳的擴增條件，可能會擴增得到非特異性條帶或者根本擴增不出條帶。擴增SMN基因片段GC含量較高，富含GC的DNA模板在常規變性溫度（94 ℃）下變性不完全，且單鏈GC富集區易于自身配對，形成發夾、環等穩定的二級結構。DNA聚合酶在帶有穩定二級結構的模板鏈上難于延伸，使PCR產物的延伸效率大幅下降。雖然提高變性溫度可使模板變性完全，但變性溫度不能過高，變性時間不能過長，否則會對模板DNA造成損害，導致出現更多脫嘌呤及脫氨基敏感位點，同時會降低DNA聚合酶活性。

參考文獻：

[1] 何印蕾.ApoE基因多態性與疾病關系研究進展[J].右江民族醫學院學報，2008（2）：285-287.

[2] QUEIPO-ORTUNO M I， TENA F， COLMENERO J D， et al. Comparison of seven commercial DNA extraction kits for the recovery of Brucella DNA from spiked human serum samples using real-time PCR[J]. Eur J Clin Microbil Infect Dis，2008，27（2）： 109-114.

[3] NASIRI H， FOROUZANDEH M， RASAEE M J， et al. Modified salting-out method： High-yield， high-quality genomic DNA extraction from whole blood using laundry detergent[J]. J Clin Lab Anal，2005，19（6）：229-232.

[4] 譚建明，謝 桐，徐琴君，等.快速鹽析法提取DNA在HLA基因分型中的應用[J].中華器官移植雜志，1996，17（1）：9-11.

[5] 駱建新，鄭崛村，馬用信，等.人類基因組計劃與后基因組時代[J].中國生物工程雜志，2003，23（1）：87-94.

[6] 郉玉華，戴素清，劉體顏，等.高GC含量DNA模板的PCR擴增[J].生物技術通訊，2013，24（5）：645-649.

[7] 曾元鳳，肖移生，梁 莉，等.長片段基因FMNL2 PCR實驗的體會[J].南昌大學學報（醫學版），2013，53（4）：19-21.

[8] 方開泰.均勻設計與均勻設計表[M].北京：科學出版社，1994. 13-17.

[9] 徐向宏，何明珠.試驗設計與Design-Expert、SPSS應用[M].北京：科學出版社，2010.177-183.

[10] 崔天盆，周 新，徐 紅，等.富GC ApoE 基因 PCR 擴增條件優化[J].上海醫學檢驗雜志，2000，15（6）：645-649.

[11] 朱 濱，王國荃，陳 堅.用均勻設計優化ApoE基因的PCR 擴增方案[J].生物化學與生物物理進展，2000，27（3）：311-315.