淡水生物污損群落中細菌的分離鑒定及觀察

劉念等

摘要：水下固形物表面微生物的黏附生長是生物污損層形成的初級階段。從長江水體分離得到3株淡水黏附菌，并對其形態特征、生長黏附特性、16S rDNA基因序列和量子點標記進行了初步研究。結果顯示，3個菌株在玻片上迅速黏附，實驗室培養生長旺盛。菌落和菌細胞均具有相似的形態特征，菌落球形突起，厚實，圓潤光滑，邊緣清晰，顏色有差異，且隨培養基成分而有所改變。胞體呈短桿狀，天然水體培養基上生長較緩慢，菌落形態有所不同，但仍能很好生長。天然流動水體完全可提供這些菌株生長所需養分，在固形物表面迅速黏附生長。

關鍵詞：淡水黏附菌；形態特征；細菌生長；量子點標記

中圖分類號：Q93 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-2882-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.018

Separation and Observation of Bacteria in Biofouling Biocoenosis

LIU Nian，XIONG Yan-fei， PENG Jun-jiang，XU Han-zhi，LIAO Li-jing，CAI Xiao-yu， XU Yun

（Institute of Biological Sciences and Technology，Wuhan University of Technology， Wuhan 430070， China）

Abstract：It is the first stage of bio-fouling layer formation when microorganisms stick to the solid surface underwater. We separated three bacterias from the Yangtze River， and first studied their morphological character， character of growth and adhesion， 16S rDNA gene-base phylogenetic， and quantum dot labeling. Results show that three strains can stick to glass quickly， and grow fast under lab culture condition. Bacteria colony and cell all have similar morphological character； a colony is globular， thick， smooth and has clear edge. But the colors of three strains are different， changing with culture medium. Single bacterium is short rod shaped；poor growth rate in natural water medium is observed； the colony morphology looks different， but still can grow well. Natural river condition can provide enough nutrients to perfectly ensure the fast growth and adhesion on the solid surface.

Key words： freshwater adhesion of bacteria； morphological character； growth of bacteria； quantum dot labeling

在海洋環境中，海洋生物依附于船舶表面和海洋水下設施生長，造成海洋生物污損[1]。研究表明，海洋生物污損過程可分為4部分，分別是基膜的形成、微生物膜的形成、海藻孢子和原生動物的附著、大型污損生物的附著。形成基膜的有機分子或無機顆粒最開始是簡單的物理吸附過程，隨著環境的變化吸附與脫附持續進行[2]。最先附著的微生物的生長會增加表面的粗糙度和疏水性[3]，細菌通過產生多糖、蛋白質、核酸和脂類，形成的胞外基質將自己包裹而得到保護[4]，生物膜形成后很難清除。防垢層表面的有機物又能作為微生物再生長的碳源[5]，進一步引導海綿、水螅、海藻、石灰蟲以及藤壺、貝類等次級生物附著。生物污損是不可逆的，給航運、海防及水產養殖等行業帶來巨大經濟損失和安全隱患。

量子點是一種具有納米尺寸的半導體晶體。與傳統的熒光染料相比，量子點擁有許多獨特的光學特性，如寬的吸收譜、窄而對稱的發射譜、耐漂白、亮度高和熒光壽命長等。由于其出色的光物理特性和相對較小的尺寸，量子點可作為生物學研究的熒光探針[6]。本研究對長江水體黏附細菌的分離、鑒定以及不同條件下的生長及細菌量子點標記等進行論述，研究了分離的淡水黏附菌的基本特性，摸索了水溶性ZnO量子點對實驗菌的標記方法，為后期進一步研究生物污損群落中細菌的附著生長及抑制附著的因素奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

對照菌：大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）由武漢大學微生物保藏中心提供。

實驗菌：取自長江水域。

培養基：牛肉膏蛋白胨固體培養基，牛肉膏蛋白胨液體培養基，3種以江水及其內容物為營養源的培養基（培養基Ⅰ為同水域江水經8層紗布與3層脫脂棉組合過濾后加瓊脂滅菌，培養基Ⅱ為同水域江水靜置后虹吸上清液加瓊脂滅菌，培養基Ⅲ為同水域江水與少量水下生物污損層固形物混勻后加瓊脂滅菌）。

量子點：ZnO量子點水溶液由武漢理工大學材料學院王藝峰老師提供。

主要試劑：十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液購買于上海碧云天生物技術有限公司，其他常用試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗菌的分離培養與純化 在長江武漢段黃鶴樓輪渡引橋水線下約20 cm處懸掛滅菌載玻片，分別于0.5、1、2、6、24 h取出實驗菌，采用影印法，將載玻片上菌體印跡至牛肉膏蛋白胨固體平板上，37 ℃恒溫培養24 h，觀察比較掛片不同時長后玻片黏附菌的數量及種類。選取優先黏附、數量較多的3種菌落，平板劃線法進行多次分離純化，獲得3個主要菌株，根據菌落顏色分別命名為AB-w（Adhesion bacteria—white）、AB-y（Adhesion bacteria—yellow）、AB-ly（Adhesion bacteria—light yellow），作為實驗菌株。

1.2.2 實驗菌的生長及菌落觀察 3種實驗菌分別在培養基Ⅰ、培養基Ⅱ、培養基Ⅲ上，于實驗室條件下，37 ℃培養，作菌落形態觀察，與富營養培養基上生長菌落比較。

1.2.3 實驗菌生長曲線測定 挑取經37 ℃活化24 h的牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面保種的實驗菌兩環，接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min培養20 h，作為實驗用菌液。上述菌液以1%接種量接種于costar 3599型無菌帶蓋96孔酶標板中，每孔100 μL，設置8個平行，37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min，酶標儀測定630 nm處的吸光值（OD），繪制生長曲線。

1.2.4 菌體形態觀察 對實驗菌進行革蘭氏染色，觀察菌體形態。以金黃色葡萄球菌或大腸桿菌混合涂片染色作進一步對照。

1.2.5 菌株AB-w的DNA提取、序列擴增測定及比對 挑取菌體于50 μL的TaKaRa可直接用于PCR的微生物裂解緩沖液（Code No.9164）中，80 ℃、15 min變性后離心取上清作為模板。使用TaKaRa 16S rDNA細菌鑒定PCR試劑盒（Code No.RR176），進行PCR擴增目的片段。反應條件為94 ℃ 5 min，一個循環；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共30個循環；72 ℃ 5 min，一個循環。產物經瓊脂糖凝膠電泳，使用TaKaRa瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒（Code No.9762）切膠回收目的片段進行DNA測序，由大連寶生物工程有限公司完成。獲得序列進行Blast搜索。

1.2.6 系統發育樹的構建 系統發育分析來源有約翰不動桿菌（A.johnsonii，Z93440）、溶血不動桿菌（A.haemolyticus，Z93437）、沃氏不動桿菌（A.lwoffii，U10875）、鮑曼不動桿菌（A.baumannii，HE978267，HE651907）、瓊氏不動桿菌（A.junii，ABl01444）以及醋酸鈣不動桿菌（A.calcoaceticus，AFl59045）。外群為莫拉氏菌（Moraxella lacunata，AF005165）[7]。應用軟件MEGA6鄰接法構建系統發育樹。

1.2.7 SDS對實驗菌生長及黏附的影響 實驗操作參照前述1.2.3進行，添加SDS至濃度分別為0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，設置4個平行。培養至46 h后去培養液，加入100 μL結晶紫染色液染色1 min，去染色液，無菌去離子水洗去殘留染液，加入200 μL無水乙醇，37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min抽提10 min，酶標儀測定490 nm處的吸光值。

1.2.8 ZnO量子點水溶液標記實驗菌及黏附情況觀察 挑取經37 ℃活化24 h的牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面保種的實驗菌兩環，接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min培養3 h，離心去上清液，菌體以少量新鮮液體培養基充分懸浮。分別取20 μL涂片，火焰固定，充分水洗。

無菌EP管中依次加入菌懸液500 μL，ZnO量子點水溶液200 μL，PBS（pH 7.4）200 μL，EDC（0.1 mol/L）100 μL[8]，混勻后37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min培養30 min，對實驗菌進行標記。結束后取20 μL涂片，火焰固定，充分水洗。

另取無菌玻璃培養皿（90 mm），將無菌玻璃片以無菌瓊脂緊貼于側壁，加入15 mL新鮮液體培養基，分別加入200 μL經ZnO量子點標記的3種實驗菌中的2種，另一種實驗菌未標記，37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min培養30 min，去培養液，無菌去離子水15 mL分3次洗滌培養皿，鑷子取出玻璃片，擦鏡紙擦去底面殘余瓊脂，1 mL滅菌去離子水清洗玻璃片，火焰固定，充分水洗。OLYMPUS IX71型倒置熒光顯微鏡紫外激發下觀察熒光。

2 結果及分析

2.1 實驗菌的分離培養

從長江武漢段江水中懸掛蓋玻片上影印培養得到大量菌落，如圖1所示。

懸掛0.5 h的玻片上即有大量菌體附著，可見不同顏色菌落，以白色居多，大小不一。隨著時間延長附著菌體迅速增加，24 h即可覆滿整個玻片表面，菌落細小，密集、整體呈黃色，難以區分不同菌落。0.5 h懸片印跡生長的菌落，菌落均突起，不透明，圓形，表面光滑、濕潤，從大小及顏色上至少可區分有3個主要菌落，經進一步分離純化，得3種菌株，分別記為AB-w、AB-y、AB-ly。

自然環境條件下，養分供應相對缺乏，溫度較低，細菌生長會緩慢一些。掛片取樣時，前6 h主要為菌體的附著過程，在玻片表面，菌體附著迅速，見圖1。0.5 h即開始有菌體黏附，至6 h時幾乎覆蓋了整個玻片表面，但菌體的黏附似乎并不是完全隨機的，從圖1的a至d，菌體并非均勻分布于玻片表面，而是較傾向于聚集成片，即已黏附菌體對后續菌體的黏附有一定的引導作用，對此，將進一步觀察研究。

2.2 實驗菌的生長及菌落觀察

AB-w、AB-y、AB-ly在牛肉膏蛋白胨培養基上生長迅速，24 h即可形成飽滿圓潤直徑約2 mm的菌落，60 h后菌落直徑約3～4 mm，菌落顏色明顯（圖2）。AB-w菌落白色，圓潤，呈球形突起，表面光滑；AB-y菌落黃色，形態與AB-w相似；AB-ly菌落淺土黃色，形態與AB-w相似。劃線邊緣處菌落均明顯較密集區菌落大，說明營養充足時均能很好地生長。

在以江水及其內容物作為營養源的培養基上，3個菌株生長明顯要緩慢。培養24 h后，在培養基Ⅰ上可見AB-w形成微小菌落，AB-y和AB-ly未見明顯生長。培養至60 h，3個菌落均肉眼可見，但菌落大小、顏色和形態均有著明顯的變形（圖3）。AB-w菌落直徑約0.2～0.3 mm，略透明，邊緣較整齊光滑，顏色不明顯；AB-y菌落直徑約0.1～0.2 mm，圓形或近圓形，中部凸起，邊緣較不整齊，略透明；AB-ly菌落直徑約0.5～1.0 mm，邊緣不規則，圓形或近橢圓形，鋪展，透明。相較于培養基Ⅰ上，3個菌株在培養基Ⅱ上形成的菌落均較厚實，略大，質地較不均勻，中部略凹陷，應為營養相對缺乏的原因。在培養基Ⅲ上，3個菌株生長水平又稍有提高，菌落明顯變大，形態更加接近球狀，顏色特征依然不明顯。可見，在營養相對缺乏的天然水體環境中，3個菌株仍可較好地生長，其中，以AB-w生長最為迅速，菌落較大，數量最多，為水體中的優勢菌種。天然流動水體中的營養物質完全可滿足這些菌株迅速生長，為次級附生生物提供養分。

2.3 實驗菌的生長曲線測定

圖4為實驗菌在牛肉膏蛋白胨培養基中的生長曲線。由圖4可見，由于接種采用的是液體培養物，前后培養環境差異不大，實驗條件下，細菌分裂迅速，對數期可持續5～16 h。在前5 h，AB-w生長迅速，之后相當長的一段時間內處于穩定期，至46 h依然無明顯下降趨勢；AB-y與AB-ly曲線類似，前16 h生長較好，穩定期較短約為8 h，之后明顯下降。

2.4 菌體形態及革蘭氏染色鑒定

菌株AB-w、AB-y、AB-ly與金黃色葡萄球菌或大腸桿菌混合革蘭氏染色結果見圖5。AB-w革蘭氏陰性，桿狀，長2～3 μm，寬1～3 μm，長寬比接近1.4∶1（圖5a）；AB-y革蘭氏陽性，桿狀，菌體長3～5 μm，寬2 μm左右，長寬比接近2.1∶1（圖5b）；AB-ly革蘭氏陰性，桿狀，菌體長3～4 μm，寬2 μm左右，長寬比接近1.5∶1（圖5c）。3種菌體形態上具有明顯的共同特征，胞體短桿狀，較大腸桿菌大。

2.5 16S rDNA 基因序列分析

將擴增得到的16S rDNA基因電泳檢測，測得其序列長度為1 451 bp。經Blast序列分析，結果表明細菌AB-w與不動桿菌同源性最高。從GenBank中調取與細菌AB-w同源性較高的菌株的16S rDNA基因序列構建系統發育樹（圖6），結果顯示，AB-w與鮑曼不動桿菌（A.baumannii）在同一分支中，一致性達到了100%。根據菌株的形態學特征和16S rRNA基因序列分析，鑒定細菌AB-w為鮑曼不動桿菌（A.baumannii）。

2.6 SDS對實驗菌抑制生長及促進黏附作用

不同濃度的SDS對3種實驗菌都有明顯的抑制生長的效果，SDS能在短時間內控制實驗菌的生長（圖7）。結晶紫染色后可明顯觀察到與未添加SDS組相比，添加SDS不能明顯減少實驗菌的黏附，此現象在前期采用玻璃片作為實驗菌黏附對象，采用印跡計數菌落時也出現過。

2.7 量子點對實驗菌的標記效果及標記實驗菌黏附分析

經處理的ZnO量子點能一定程度上標記實驗菌，單獨處理一種實驗菌，計數不同顯微視野下的標記率可以達到51%～99%，波動較大；同時標記2種實驗菌，另一種未標記，將3種菌混合培養，對熒光及明場下玻璃表面的黏附菌體數量進行比較，同樣存在標記率波動較大的現象。AB-w未標記組，標記率在27.4%～79.0%；AB-y未標記組，標記率在38.2%～88.3%；AB-ly未標記組，標記率在38.0%～78.3%。相比而言革蘭氏陰性菌似乎更易被標記。單一實驗菌標記如圖8所示。

3 小結與討論

從長江水體分離得到3株淡水黏附菌，在玻片上粘附迅速，實驗室培養生長旺盛。菌落和菌細胞均具有相似的形態特征，菌落球形突起，厚實，圓潤光滑，邊緣清晰，顏色有差異，且隨培養基成分而有所改變。胞體呈短桿狀，AB-w與AB-ly革蘭氏染色陰性，AB-y革蘭氏染色陽性。天然水體培養基上生長較緩慢，菌落形態有所不同，主要表現為營養缺乏時，菌落沿培養基鋪展生長。天然流動水體中完全可提供這些菌株生長所需養分，特別是在春夏季，這些菌株可在水中固形物表面迅速黏附生長，促進次級附生生物的附著生長，形成生物污損層，造成生物腐蝕。

對AB-w進行了16S rDNA基因序列分析，其測試結果顯示為鮑曼不動桿菌，與該菌的革蘭氏染色結果與強黏附性相一致。學者針對鮑曼不動桿菌的研究主要針對其耐藥性[9，10]，未有系統研究其強黏附作用與生物污損的關系。

低濃度的SDS溶液即可快速而顯著地控制實驗菌的生長，由于SDS溶液易起泡，加樣時難免產生少許氣泡，氣泡雖然可以在4 h內全部消除，但仍然會對前期測量產生一定的影響。細菌生長受到抑制的情況下，其黏附結果受影響不大，甚至黏附量增多，其原因還待進一步研究。

實驗條件下，水溶性ZnO量子點標記實驗菌的效果一般，其中AB-w與AB-ly兩種革蘭氏陰性菌標記效果相對較好，革蘭氏陽性菌AB-y效果較差。采用金黃色葡萄球菌與大腸桿菌作為被標記物時，結果同樣如此。更適合的標記條件與標記質量的影響因素待進一步研究。

參考文獻：

[1] YEBRAD M，KIIL S，JOHANSEN K D. Antifouling technology-past，present and future steps towards efficient and environmentally friendly antifouling coatings[J]. Progress in Organic Coatings，2004，50（2）：75-104.

[2] WALLSTROM E，JESPERSEN H T，SCHAUMBRUG K. A new concept for anti-fouling paint for Yachts[J]. Progress in Organic Coatings，2011，72（1）：109-114.

[3] PASMORE M， TODD P， SMITH S， et al. Effects of ultrafiltration membrane surface properties on Pseudomonas aeruginosa biofilm initiation for the purpose of reducing biofouling[J]. Journal of Membrane Science，2001，194（1）：15-32.

[4] FLEMMING H C，WINGENDER J. The biofilm matrix[J]. Nature Reviews Microbiology，2010，8（9）：623-633.

[5] VANDER HOEK J P，HOFMANJ AMH，BONN？魪 PAC，et al. RO treatment： Selection of a pretreatment scheme based on fouling characteristics and operating conditions based on environmental impact[J]. Desalination，2000，127（1）：89-101.

[6] 王曉暄，曲 峰，陳祖彬，等.用量子點標記活細胞[J].生物物理學報，2010，26（5）：365-372.

[7] 顧澤茂，柳 陽，陳昌福，等.鮑曼不動桿菌斑點叉尾鮰株的分離與鑒定[J].華中農業大學學報，2010，29（4）：489-493.

[8] 蔡朝霞，阮曉娟，石寶琴，等.水溶性CdSe量子點的合成及其作為熒光探針對大腸桿菌的快速檢測[J].分析試驗室，2011， 30（3）：107-110.

[9] 游 洋，顧偉杰，王 錚，等.鮑曼不動桿菌生物膜形成與耐藥的相關性初探[J].中國病原生物學雜志，2012，7（7）：500-502.

[10] 張銀旺.鮑曼不動桿菌耐藥性及耐藥譜分析[J].中國衛生檢驗雜志，2014，24（10）：1507-1514.