高效氯氰菊酯暴露下草魚器官堿性磷酸酶活性的變化

牛景彥 劉占才　王育水　張安世

摘要：研究了暴露在不同濃度高效氯氰菊酯下草魚（Ctenopharyngodon idellas）鰓、肝胰臟和腎臟組織中堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）的活性變化。試驗中高效氯氰菊酯濃度設5組（0、0.5、1.0、3.0和5.0 μg/L），每組分別于1、5和12 d時取樣，測定鰓、肝胰臟和腎臟組織中AKP的活性。結果表明，0.5 μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d時，鰓中AKP活性顯著下降（P<0.05），肝胰臟和腎臟中的AKP活性無顯著變化（P>0.05）；暴露5 d時，鰓和腎臟中AKP活性顯著或極顯著降低（P<0.05，P<0.01），肝胰臟中AKP活性無顯著變化（P>0.05）；暴露12 d時，鰓和腎臟中AKP活性極顯著下降（P<0.01），肝胰臟中AKP活性無顯著變化（P>0.05）。1.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d，肝胰臟和腎臟中AKP活性無顯著變化（P>0.05），鰓中AKP活性顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01）；暴露5 d時，腎臟中AKP活性顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01），肝胰臟中AKP活性無顯著變化（P>0.05）；暴露12 d，鰓、肝胰臟和腎臟中AKP活性顯著下降（P<0.01）。3.0 μg/L和5.0 μg/L高效氯氰菊酯顯露1、5和12 d，所測定組織中AKP活性均顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01）。

關鍵詞：草魚（Ctenopharyngodon idellas）；高效氯氰菊酯；堿性磷酸酶活性

中圖分類號：Q956.86 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-2968-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.041

Changes of Alkaline Phosphatase Activity in Organs of Grass Carp Exposed to the Different Beta-cypermethrin Concentration

NIU Jing-yan，LIU Zhan-cai，WANG Yu-shui，ZHANG An-shi

（Department of Technology， Jiaozuo Teachers College， Jiaozuo 454001， Henan，China）

Abstract： To study dynamic changes of alkaline phosphatase activity（AKP） in gill， hepatopancreasand kidney of grass carp（Ctenopharyngodon idellas）exposed to the different Beta-cypermethrin concentration can be helpful to understand of Beta-cypermethrin effect on AKP. In this study，grass carps were randomly divided into five groups including control group and four different Beta-cypermethrin concentration groups （0.5、1.0、3.0 and 5.0 μg/L）.Each was in replication. Biochemistry methods were used to measure AKP activity of gill，hepatopancreas and kidney sampled on day 1，5 and 12，respectively. The results were as follows： contrast to the control，for 0.5 μg/L，AKP activity of gills was sharply reduced（P<0.05）， but that of hepatopancreas and kidneys didnt significantly change （P>0.05）on day 1，then AKP activity of gills and kidneys sharply reduced（P<0.01，P<0.05），but no significant change happened for that of hepatopancreas（P>0.05） on day 5. Finally that of gills and kidneys significantly decreased （P<0.01），and that of hepatopancreas returned to the normal level on day 12.For 1.0 μg/L，AKP activity of gills was sharply reduced（P<0.01，P<0.05），but that of hepatopancreas and kidneys didnt significantly change （P>0.05）on day 1，then AKP activity of serum significantly increased（P<0.01），that of spleens and kidneys were sharply reduced（P<0.01，P<0.05），but that of hepatopancreas didnt significantly change（P>0.05） on day 5. Finally AKP activity of serum didnt sharply change （P>0.05），that of gills，hepatopancreas，spleens and kidneys significantly decreased （P<0.01）on day 12. For 3.0 μg/L and 5.0 μg/L，AKP activity of serum，gills，hepatopancreas，spleens and kidneys significantly decreased（P<0.01，P<0.05）.

Key words： Ctenopharyngodon idellas；beta-cypermethrin；activity of alkaline phosphatase

高效氯氰菊酯是一種高效低毒的擬除蟲菊酯類農藥，因其對哺乳動物、鳥類的低毒性和對有害昆蟲的高效殺滅性而被廣泛的應用于農作物、園藝植物、家庭衛生害蟲的防治[1]。在水產養殖方面也被作為有機磷農藥的替代品用來防治寄生蟲和控制有害水生昆蟲的過度增殖[2，3]。由于過量使用，雨水沖刷使高效氯氰菊酯通過地表徑流進入河道、湖泊等水體，導致非殺滅目標的水生無脊椎動物、魚類等對神經毒素類農藥非常敏感的生物受到影響[4，5]。研究表明，擬除蟲菊酯對魚類的毒性是哺乳動物和鳥類的1 000倍[6]。目前，關于高效氯氰菊酯對魚類的影響方面的研究報道很多，主要集中于對魚類的毒性研究方面[7，8]，對魚類的代謝酶活性的影響方面也有一定量的報道[9，10]。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）在生物體內核酸、蛋白質和脂類等物質代謝中起著重要的作用，但鮮見高效氯氰菊酯對魚類AKP活性影響方面的報道。高效氯氰菊酯在水體中的濃度通常低于魚類的致死濃度，魚類長期在該環境中生存，必然會對其生理代謝造成影響。草魚（Ctenopharyngodon idellas）是我國重要的淡水養殖魚類，對環境因子的變化較為敏感，本試驗研究了低濃度高效氯氰菊酯對草魚AKP活性的影響，對探索高效氯氰菊酯對魚類毒性作用機理有著重要的理論意義，同時對評估魚類產品的質量及指導水產養殖業的健康發展也有著積極的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用草魚為魚種場同批、同池養殖的健康草魚，體重（100±15） g，體長（15±3） cm。

1.2 適應性馴化

將草魚隨機分為5組，每組30尾，每組各兩個平行，放入飼養箱中適應性馴養1周，期間定時投餌。養殖用水為充氧曝氣的自來水，每箱放水100 L。光周期12L∶12D；養殖水溫（19±2） ℃；每3 d換水1次，小型增氧機增氧，各組飼養管理方法相同。

1.3 高效氯氰菊酯暴露處理

采用常規急性毒性試驗方法[11]，測定了高效氯氰菊酯對草魚的96 h半致死濃度（LC50）為6.1 μg/L，設定高效氯氰菊酯濃度為0.5、1.0、3.0、5.0 μg/L 4個處理組（以市售0.4%的高效氯氰菊酯乳液配制）和1個對照組，每組2個平行，正常投喂。試驗開始后，于1、5、12 d分別從各濃度組隨機取10尾魚，用于AKP活性的測定。

1.4 酶粗提液制備

解剖魚體，取出鰓、肝胰臟和腎臟組織，按1∶19（m/V）加入0.9%生理鹽水，冰浴勻漿后4 ℃下12 000 r/min離心10 min后取上清液，保存于-20 ℃。

1.5 粗提液蛋白定量

蛋白質定量參照Bradford[12]的方法，標準蛋白為牛血清白蛋白（BSA，購于BBI公司）。

1.6 酶活性測定

AKP活性測定采用陳清西等[13]的方法進行測定。AKP活性單位定義：28 ℃下每克粗蛋白15 min內催化對硝基苯磷酸二鈉（pNPP，購于BBI公司）生成1 mg對硝基酚的酶量為1個酶活單位（U/g）。

1.7 數據處理

采用EXCEL2003統計分析軟件進行One-way ANOVA分析和獨立性t檢驗，顯著性水平設為P<0.01或P<0.05。

2 結果與分析

2.1 高效氯氰菊酯暴露下草魚鰓中AKP活性的變化

在不同濃度高效氯氰菊酯下暴露不同時間，對照組草魚鰓暴露1、5、12 d時AKP活性無顯著變化（P>0.05），各處理組在不同暴露時間，AKP活性均顯著或極顯著性下降（P<0.05，P<0.01），并表現出明顯的時間、劑量效應（圖1）。

2.2 高效氯氰菊酯暴露下草魚肝胰臟中AKP活性的變化

對照組暴露1、5、12 d時酶活性之間無顯著變化（P>0.05）。0.5 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5和12 d時，酶活性無顯著變化（P>0.05）；1.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5 d對酶活性無顯著影響（P>0.05），12 d時酶活性顯著下降（P<0.05）；3.0 μg/L和5.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5和12 d時，酶活性均顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01）（圖2）。

2.3 高效氯氰菊酯暴露下草魚腎臟中AKP活性的變化

對照組暴露1、5、12 d 時，腎臟中AKP酶活性之間無顯著變化（P>0.05）。0.5 μg/L和1.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d，酶活性無顯著變化（P>0.05），暴露5、12 d，酶活性顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01）；3.0 μg/L和5.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5和12 d，酶活性均極顯著下降（P<0.01） （圖3）。

3 小結與討論

AKP是動物代謝過程中重要的調控酶，是一種非特異性的磷酸單酯酶，主要參與生物體對物質的消化、吸收、轉運，調節動物體內鈣、磷吸收，在維持鈣、磷平衡方面起著重要作用，是魚類賴以生長、生存的重要酶類之一[12]。在物質交換、吸收轉運旺盛的器官中，AKP均呈現出高活性。

Clark等[14]研究認為菊酯類殺蟲劑對魚類毒性極大，是由于魚類的鰓組織極易從外界吸收此類物質。本試驗中，短時間（1 d）低濃度（0.5 μg/L）暴露下，草魚鰓中AKP活性顯著下降的結果印證了這一觀點。王朝暉等[15]研究發現，菊酯類殺蟲劑對鰓組織能夠造成病理性損傷，破壞鰓組織的離子代謝和滲透平衡，從而影響魚鰓的生理代謝，本試驗各處理組AKP活性均顯著低于對照的結果也佐證了這一論點。

有研究[16-18]發現，魚體處于氯氰菊酯環境脅迫初期，體內產生過量的氧自由基，誘導SOD活性提高使二者達到一種新的平衡；但隨著氯氰菊酯作用時間的延長，魚體會產生大量的氧自由基，而SOD酶活性被抑制，導致肝組織損傷。本試驗中草魚肝胰臟中AKP活性的變化表明，在低濃度（0.5、1.0 μg/L）、短時間（1、5 d）暴露下，肝胰臟對高效氯氰菊酯有一定的耐受性；但隨著高效氯氰菊酯濃度的增加（3.0、5.0 μg/L）和暴露時間（12 d）的延長，活性受到顯著或極顯著抑制，這可能與魚類肝胰臟中缺少可分解高效氯氰菊酯的酶有關，當高效氯氰菊酯的脅迫作用超出了肝胰臟的耐受能力后，其代謝功能受到明顯的影響。

有報道發現，氯氰菊酯能夠通過抑制魚類細胞質膜ATP酶的活性，使質膜主動轉運受到破壞，進而影響質膜的離子轉運和離子平衡，導致質膜逆濃度梯度轉運離子產生障礙[19]。腎臟作為魚體調節電解質平衡的主要器官，在氯氰菊酯的脅迫下，其保鈉排鉀功能減弱，導致魚體內電解質平衡失調，進而影響腎臟的生理功能。本研究中氯氰菊酯對腎臟中AKP活性具有顯著抑制作用，并表現出明顯的劑量時間效應，也佐證了這一點。

本研究發現，草魚鰓、肝胰臟和腎臟中AKP對高效氯氰菊酯的敏感性是不同的，這可能與它們不同的生理功能有關；高效氯氰菊酯的脅迫可以顯著影響鰓、肝胰臟和腎臟的生理代謝，表明高效氯氰菊酯對草魚具有較強的毒性。

參考文獻：

[1] 胡志強，許良忠，任雪景，等.擬除蟲菊酯類殺蟲劑的研究進展[J].青島化工學院學報，2002，23（1）：48-51.

[2] WENDT-RASCH L，PIRZADEH P， WOIN P. Effects of metsulfuron methyl and cypermithrin exposure on freshwater model ecosystems[J].Aquat Tocxicol， 2003，63（3）：243-256.

[3] DAS B K， MUKHERJEE S C. Toxicity of cypermethrin in Labeo rohita fingerlings： Biochemical， enzymatic and haematological consequences[J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Phamacol， 2003，134（1）： 109-121.

[4] MIAN L S，MULLA M S.Effects of pyrethroid insecticides on nontarget invertebrates in aquatic ecosystems[J]. J Agric Entomol 1992， 9： 73-98.

[5] PHILIP G H， REDDY P M， SRRIDEVI G. Cypermethrin induced in vivo alterations in the carbohydrate metabolism of freshwater fish，Labeo rohita[J] Ecotoxicol Environ Saf，1995，31： 173-178.

[6] EELLS J T， RASMUSSEN J L， BANDETTINI P A， et al. Differences in the neuroexcitatory actions of pyrethroid insecticides and sodium channel-specific neurotoxins in rat and trout brain synaptosomes[J]. Toxicol Appl Pharmacol， 1993，123：107-119.

[7] USMANI K， KNOWLES C. Toxicity of pyrethroids and effect of synergists to larval and adult Helicoverpa zea， Spodoptera frugiperda，and Agrotis ipsilon（Lepidoptera： Noctuidae）[J]. J Econ Entomol，2001，94： 868-873.

[8] 王明學，扶 慶，周志剛，等.溴氰菊酯對草魚早期發育階段的毒性效應[J].水利漁業，2000，20（6）：39-40.

[9] 周志剛，王明學，呂敢堂，等.溴氰菊酯對草魚魚種腦AchE及ATP酶活性的影響[J].華中農業大學學報，1999，18（2）：176-179.

[10] KAMALAVENE K， GOPAL V， SAMPSON U，et al. Effect of pyrethroids on carbohydrate metabolic pathways in common carp，Cyprinus carpio[J]. Pest Manag Sci，2001，57：1151-1154.

[11] 孟紫強.環境毒理學基礎[M].北京：高等教育出版社，2000.361-363.

[12] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein-dye binding[J].Anal biochem，1976，72：248-254.

[13] 陳清西， 顏思旭.文昌魚堿性磷酸酶的必需基因研究[J].廈門大學學報（自然科學版），1986，25（5）：568-573.

[14] CLARK J R， JAMES M， PATRICK J，et al. Relative sensitivity of six estuarine fishes to carbophenothi on chloropyrifos and fenvalerate[J]. Ecotoxicol Environ Saf，1985，10：382-390.

[15] 王朝暉，尹伊偉，許忠能，等.8種擬除蟲菊酯農藥對稀有鮈鯽的急性、亞急性毒性研究[J].應用與環境生物學報，1998，4（4）：379-382.

[16] ROBERTS M H， SEVED D W， FELTON S P. Temporal changes in feral AHH and sod activity in feral spot from the Elizabeth river a polluted sub-estuary[J]. Mar Environ Res， 1987，23：89-101.

[17] 徐立紅，張甬元，陳宜瑜.分子毒理學的研究進展及其在水環境保護中的意度[J].水生生物學報，1995，19（2）：171-185.

[18] 謝文平，馬廣智.氯氰菊酯對草魚鰓和肝組織超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響[J].水產科學，2003，22（6）：5-7.

[19] 許陽光，李學鋒，張文吉，等.低濃度醚菊酯對鯉魚生長及生理生化指標影響的研究[J].河北大學學報，2005，28（1）：69-73.