高叢越橘組培快繁技術(shù)研究

李 森 ，高麗霞，劉 念 ，張施君*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院科技處，廣東廣州 510225;2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院健康農(nóng)業(yè)研究所，廣東廣州 510225;3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院，廣東廣州 510225)

越橘(Vaccinium spp.)是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)多年生漿果類灌木，果實(shí)藍(lán)色或紅色，其中藍(lán)果越橘俗稱藍(lán)莓。越橘果實(shí)皮薄，風(fēng)味酸甜可口，含有豐富的花色素苷、黃酮等生理活性成分，具有增強(qiáng)心臟功能、預(yù)防癌癥的功效，能防止腦神經(jīng)衰老、增強(qiáng)腦力;可以強(qiáng)化視力，減輕眼球疲勞［1－2］。近年來，越橘在市場上受到追崇，目前生產(chǎn)栽培的主要類型包括兔眼越橘(Vaccinium ashei)、矮叢越橘(Vaccinium angustifolium)、高叢越橘(Vaccinium corymbosum)等［3］。

越橘的常規(guī)繁殖方法有播種、嫁接和扦插法，但播種繁殖發(fā)芽率低，嫁接繁殖成活率低，扦插繁殖的繁殖系數(shù)小，周期長，均難以滿足市場對種苗的需求。利用組織培養(yǎng)來快速高效地獲得大量無性系組培苗，是獲取越橘優(yōu)質(zhì)種苗的有效途徑。許多學(xué)者進(jìn)行了兔眼越橘、高叢越橘、矮叢越橘等不同栽培類型的組織培養(yǎng)技術(shù)研究［4－8］。在越橘的組織培養(yǎng)中，常用的外植體包括葉片、莖尖和莖段。以葉片為外植體的再生體系需要經(jīng)過葉片脫分化形成愈傷組織，愈傷組織再分化成苗的芽間接再生途徑［8－9］，這種芽再生方式常用于建立越橘的遺傳轉(zhuǎn)化體系。而通過莖尖或莖段的腋芽萌發(fā)形成不定芽的增殖體系屬于芽直接再生途徑，是越橘試管苗規(guī)模化快速繁殖的主要方法［10－11］。筆者以適合華南地區(qū)種植的高叢越橘‘比洛克西’的莖段為試驗(yàn)材料，探討不定芽的直接再生方式，建立越橘的組培快繁體系，為試管苗規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料高叢越橘‘比洛克西’種植在仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)場，剪取當(dāng)年生嫩枝為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同消毒條件對莖段誘導(dǎo)的影響。從農(nóng)場采回試驗(yàn)材料，剪去葉片，切成約3 cm的莖段，用自來水加洗衣粉沖洗10 min，再用自來水沖洗10 min，在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡30 s，再用無菌水沖洗1次，然后分別用0.1%的HgCl2(W/V)和5%的NaClO(W/V)為消毒劑浸泡處理，HgCl2的消毒時(shí)間分別設(shè)為3、4和5 min，NaClO的消毒時(shí)間分別設(shè)為5、10和15 min;消毒完成后用無菌水沖洗6次，用無菌濾紙吸干莖段上的水分，將莖段接入WPM+ZT 0.5 mg/L的初代培養(yǎng)基中，每瓶接種4個(gè)外植體，每個(gè)處理5瓶，3次重復(fù)。接種30 d后，統(tǒng)計(jì)污染率和誘導(dǎo)率。污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;誘導(dǎo)率=無菌外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.2 不定芽的繼代增殖。將誘導(dǎo)獲得的莖段分切成約2 cm，轉(zhuǎn)接到分別附加不同組合和濃度6-BA、ZT、NAA的WPM和MS培養(yǎng)基上，每處理5瓶，每瓶接種4段外植體，3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計(jì)分枝數(shù)、不定芽數(shù)和增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=不定芽數(shù)/接種芽數(shù)×100%。

1.2.3 試管苗的生根培養(yǎng)。將無菌苗分切成約2 cm，轉(zhuǎn)接到WPM附加不同濃度IBA的培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗和生根培養(yǎng)，每處理5瓶，每瓶接種4段外植體，60 d后統(tǒng)計(jì)生根率、生根數(shù)和根長，3次重復(fù)。

1.2.4 試管苗的移栽。用鑷子將高達(dá)5 cm以上的試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入泥炭土基質(zhì)中，澆透水，環(huán)境溫度(22～25)℃，濕度80%，60 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.2.5 培養(yǎng)條件。以上培養(yǎng)基中均添加30 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂，pH 5.2，培養(yǎng)溫度(25 ± 2)℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間 12 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒條件對莖段誘導(dǎo)的影響 由表1可知，5%Na-ClO的消毒效果不理想，莖段在5%NaClO中處理15 min后，污染率仍高達(dá)33.3%，與0.1%HgCl2處理3 min的污染率相當(dāng)。用0.1%HgCl2只需處理4～5 min，即可得到較理想的滅菌效果，污染率降至20.0%以下。莖段經(jīng)0.1%HgCl2處理4 min的效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)68.3%，莖段接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(圖1-1)，10 d后可見腋芽萌發(fā)，葉片逐漸展開，莖干伸長(圖1-2)。

表1 不同消毒條件對莖段誘導(dǎo)的影響

2.2 不定芽的增殖培養(yǎng) 由表2可知，6-BA的濃度從2.0 mg/L增至5.0 mg/L，苗的分枝數(shù)、不定芽數(shù)和增殖系數(shù)有所增加;在培養(yǎng)基中再添加NAA，各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化，說明NAA的增殖效果不佳。ZT對越橘增殖培養(yǎng)的效果比6-BA顯著，在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的ZT，莖段均有明顯生長，萌發(fā)分枝和新芽，ZT的濃度從2.0 mg/L增至3.0 mg/L，各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化，說明ZT 2.0 mg/L是不定芽增殖的合適濃度(圖1-3)。在ZT的基礎(chǔ)上再添加NAA，苗的基部出現(xiàn)了少量愈傷組織，而分枝數(shù)、不定芽數(shù)和增殖系數(shù)均顯著下降，說明NAA對不定芽增殖沒有促進(jìn)作用。WPM比MS培養(yǎng)基更適于越橘的離體培養(yǎng)，各項(xiàng)指標(biāo)均明顯高于MS培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對增殖培養(yǎng)的影響

2.3 試管苗的生根與移栽 由表3可知，將高度約2.0 cm的苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上，不同濃度IBA誘導(dǎo)的發(fā)根率無顯著差異，0.2 mg/L和0.5 mg/L IBA誘導(dǎo)出的根數(shù)和根長無顯著差異，植株在IBA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基上發(fā)根整齊，苗生長健壯(圖1-4)。

試管苗移栽前3～5 d先將瓶蓋打開，在培養(yǎng)室內(nèi)煉苗，移栽時(shí)用鑷子將試管苗夾出，用清水沖洗，然后移入泥炭土基質(zhì)中，加遮陰網(wǎng)，溫度控制在25℃左右，保持80% ～90%的相對濕度，移栽成活率達(dá)到80%(圖1-5)。

表3 不同IBA濃度對試管苗生根的影響

3 結(jié)論與討論

0.1%HgCl2和5%NaClO是植物材料常用的消毒劑［12－13］。該試驗(yàn)結(jié)果表明，HgCl2處理越橘莖段 3 ～5 min，誘導(dǎo)成功率達(dá)60%以上，而NaClO則需要15 min才能達(dá)到較好的消毒效果。在繼代增殖培養(yǎng)中，ZT比6-BA更有利于越橘增殖，ZT 2.0 mg/L適宜越橘增殖培養(yǎng)，NAA則誘導(dǎo)了愈傷組織的產(chǎn)生，不利于莖段的增殖和生長，這與前人關(guān)于同屬樹種組培的研究相符［8－11］。

不定根的發(fā)生與基因型和培養(yǎng)條件密切相關(guān)，該試驗(yàn)選用越橘品種‘比洛克西’，生根最適培養(yǎng)基為WPM+IBA 0.2 mg/L，生根率為63.3%。不同品種試管苗的生根表現(xiàn)還有待進(jìn)一步研究。試管苗移栽成活率的高低除與苗的健壯程度有關(guān)外，還與移栽基質(zhì)、環(huán)境溫度及移栽后的栽培管理有關(guān)。該試驗(yàn)初步設(shè)置了泥炭土為栽培基質(zhì)，今后還將對栽培基質(zhì)配方和移栽馴化條件進(jìn)行更深入的研究，以期提高試管苗的移栽成活率。

圖1 越橘‘比洛克西’的組培快繁

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