正交試驗優選柴胡中黃酮類化合物提取工藝的研究

唐志國，王 斌，張騰霄

(1.綏化市食品藥品檢驗檢測所，黑龍江綏化 152061;2.綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化 152061)

中藥柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.和狹葉柴胡B.scorzonerifolium Willd.的干燥根，前者習稱北柴胡，后者習稱南柴胡［1］。柴胡能散風退熱、升陽疏肝，用于治療感冒發熱、寒熱往來、痢疾、肝郁氣滯、胸脅脹痛、子宮脫垂、脫肛、月經不調等癥［2］。北柴胡主產于河北、河南、遼寧、陜西等。柴胡為常用大宗藥材，其重要的藥用價值使需求逐年增加，不僅國內需要量大，且大量出口。由于長期依賴采挖，野生資源及其生境破壞嚴重，資源已近枯竭，目前商品柴胡主要依賴栽培。柴胡存在嚴重的種內和種間類型混雜的現象，導致柴胡品種優劣不等的問題［3］。不同地區使用的藥用部位也不盡相同，藥典規定柴胡的藥材為柴胡的根，但市場上的藥材往往是根和5～10 cm莖的混品入藥，有人則以地上部分入藥。

柴胡中的有效成分為柴胡皂苷、甾醇、揮發油和多糖等，此外，還含有黃酮類成分。黃酮類化合物對人體在抗腫瘤、抗衰老及心血管等疾病的治療和預防有重要意義［4－5］。如蘆丁具有抗氧化、抗基因突變和降低毛細血管異常通透性及脆性的作用，臨床上用于治療過敏性紫癜及各種因毛細血管脆性增加而引起的出血性疾病，也用于治療高血壓和老年氣管炎等［6］。槲皮素是黃酮類化合物中具有代表性的一種，研究發現槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病并發癥等多種生物活性及藥理作用，對呼吸道疾病，特別是對哮喘病和支氣管疾病有較好的作用［6－7］。目前國內關于柴胡提取工藝的文獻報道較多，但多以皂苷類、揮發油指標進行考察，很少有單獨考察黃酮類化合物的文獻，因此，該研究采用正交試驗考察柴胡中黃酮類化合物的提取及其不同部位的含量，為提高仿生栽培柴胡的質量和療效打下基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀(2996紫外檢測器);KQ－500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司);METTLER AE240電子天平RE52－86A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥 仿生栽培樣品采自黑龍江省的明水縣柴胡種植基地，野生柴胡樣品采自黑龍江省的明水縣本地;蘆丁(批號100080－200801)、槲皮素(批號 100081－200502)、山柰素(批號110861－200805)、異鼠李素(批號110860－200504)均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%;乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3 方法

1.3.1 柴胡中黃酮類化合物含量測定。

1.3.1.1 色譜條件。迪馬 C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)－0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫，0～15 min(5% ～20%A)、15～30 min(20% ～35%A)、30～45 min(35% ～45%A)、45～55 min(45% ～50%A)、55～60 min(50% ～5%A);洗脫時間為60 min;檢測波長360 nm;流量1.0 ml/min;柱溫為 35 ℃，進樣量 20 μl。

1.3.1.2 標準曲線及線性范圍。準確稱取蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品各約20 mg，分別置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。混勻后分別進樣 2、5、10、20、30 μl，按“1.3.1.1”色譜條件作HPLC分析。以峰面積對進樣量進行回歸處理，得蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的線性回歸方程和線性范圍(表1)。

1.3.2 樣品測定。精密吸取 20 μl樣品溶液，在“1.3.1.1”色譜條件下測定，記錄峰面積，分別計算相應黃酮類化合物的含量，再計算總量。

1.3.3 正交試驗。以柴胡中4種黃酮類化合物含量的總量為指標，設定pH=7、浸漬時間30 min、提取時間20 min，分別以乙醇溶度、料液比、浸漬溫度和超聲功率等主要因素及不同水平進行L9(34)正交設計(表2)，篩選最佳工藝。

表1 4種黃酮標準曲線

表2 正交試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果 由表3可知，浸漬溫度的極差Rj最大，其次是超聲功率，故對黃酮類化合物提取效果的影響大小順序是A＞D＞B＞C，即浸漬溫度＞超聲功率＞乙醇濃度＞料液比。由于料液比影響不顯著，故綜合考慮，選擇最佳方案為A1B1C1D2，即5倍量的60%乙醇50℃浸漬，80 W功率超聲提取20 min。

表3 正交試驗結果

2.2 最佳方案的驗證試驗 取柴胡的根、莖和葉分別按最佳方案提取，重復2次。結果(表4)顯示，此最佳工藝提取黃酮類化合物其含量較高，且工藝條件穩定可靠、重現性好。

表4 驗證試驗結果 %

3 討論

(1)黃酮類化合物穩定性差，在較高溫度下易分解氧化，因此提取時注意溫度的控制。

(2)分析葉片和莖中黃酮類化合物的含量高于傳統使用的根，劉秀芳等研究認為小葉黑柴胡莖葉中總黃酮具有很好的抗氧化活性［8］;詹雪晶等研究認為柴胡莖葉中總黃酮對四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝損傷有保護作用［9］。故很有必要對莖、葉進行進一步的研究，擴大柴胡用藥部位。

［1］鄭漢臣，蔡少青.藥用植物學與生藥學［M］.北京:人民衛生出版社，2003.

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［3］ZHANG T T，ZHOU J，WANG Q.HPLC analysis of flavonoids fromthe aerial parts of Bupleurum species［J］.Chin J Nat Medi，2010，8(2):107 －113.

［4］ELISA T，MAURIZIO L G，SANTO G，et al.Cirus flavonoids molecularstructure，biological activity and nutritional properties:A review ［J］.Food Chemistry，2007，104(2):466 －479.

［5］CRISTINA I M，ALESSANDRA B，SARA V，et al.Flavonoid characterizationand in vitro antioxidant activity of Aconitum anthora L.(Ranunculaceae)［J］.Phytochemistry，2008，69(5):1220 －1226.

［6］岳志勁，關翠林，王海青，等.RP-HPLC法測定柴胡中四種黃酮類成分的含量［J］.山西大同大學學報:自然科學版，2010，26(4):35 －38.

［7］王艷芳，王新華，朱宇同.槲皮素藥理作用研究進展［J］.天然產物研究與開發，2003，15(2):171 －173.

［8］劉秀芳，李婷婷，蔡光明，等.小葉黑柴胡莖葉總黃酮體外抗氧化活性的研究［J］.中南藥學，2011，9(3):172 －175.

［9］詹雪晶，蔡霈，蔡光明，等.小葉黑柴胡莖葉總黃酮對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護作用［J］.中南藥學，2011，9(4):241－243.