辣椒疫霉產(chǎn)孢能力與致病力的相關性分析

李 萍，張茜茹，吳 亞，高智謀*

(1.安慶職業(yè)技術學院園林園藝系，安徽安慶 246003;2.安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，安徽合肥 230036)

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一種重要的植物病原卵菌，常威脅茄科、葫蘆科和豆科等多種農(nóng)作物的生產(chǎn)，給全世界蔬菜產(chǎn)業(yè)造成嚴重危害［1－2］。該病菌廣泛分布于北京、上海、湖南、安徽、甘肅、新疆、陜西、青海、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、山東、云南、臺灣、湖北、海南等地，并在江蘇、浙江、安徽、上海等長江中下游地區(qū)造成嚴重損失［3－7］。由辣椒疫霉引起的辣椒疫病成為我國辣椒主產(chǎn)區(qū)嚴重病害［8］，辣椒疫病發(fā)生時，葉片、果實和莖部均可受害，引起呈暗綠色水漬狀，濕度大時產(chǎn)生白色菌絲層，最后壞死［9］。

辣椒疫霉主要以卵孢子和厚垣孢子在土壤中或殘留在地上的病殘體內(nèi)越冬，作為來年病害發(fā)生的初侵染源。卵孢子在土中病殘體內(nèi)可以存活3年，條件適宜時，卵孢子可萌發(fā)并侵染寄主植物的根系或地下部分，或者萌發(fā)后產(chǎn)生孢子囊，孢子囊釋放出游動孢子，經(jīng)雨水或灌溉水傳播至植物地上莖、葉及果實上引起發(fā)病。在合適條件下，辣椒疫霉侵入辣椒等寄主后通常在幾天內(nèi)就可在病部表面產(chǎn)生大量孢子囊并釋放出游動孢子，成為再侵染源，借助風和雨水或帶病的種苗、土壤及灌溉水進行傳播［10］。因此，游動孢子囊的產(chǎn)量是辣椒疫病發(fā)生流行的必要條件，但有關辣椒疫病發(fā)病程度與游動孢子囊產(chǎn)量的關系尚未見報道。為此，筆者研究了游動孢子囊產(chǎn)量與辣椒疫霉對辣椒的致病力關系，從生物學特性方面探討了辣椒疫霉的致病力分化機制，從統(tǒng)計學上剖析了致病力分化與游動孢子囊產(chǎn)量的關系，旨在為該病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試作物。辣椒品種為“艷陽”。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)［11］:將200 g新鮮胡蘿卜切成小片，加去離子水500 ml，煮沸后計時30 min，用雙層紗布過濾去渣，補水至1 000 ml，加入瓊脂20 g，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。10%V8培養(yǎng)液:100 ml V8汁加入1 g CaCO3，1 500 r/min 離心10 min，上清液與去離子水按1∶9的比例稀釋，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株的分離及其致病力測定。2006～2010年在安徽淮南(HN)、合肥(HF)、潛山(QS)、岳西(YX)、和縣(HX)、石臺(ST)、銅陵(TL)、阜陽(FY)和亳州(BZ)等縣(市)辣椒上采集辣椒疫病病株，采用組織分離法，使用選擇性培養(yǎng)基對病原菌進行分離，共獲得56個分離物，分離獲得的培養(yǎng)物經(jīng)形態(tài)學鑒定后，單孢分離并保存。采用活體刺莖接種法測定辣椒疫霉不同菌株對辣椒的致病力。

1.2.2 游動孢子囊產(chǎn)量測定。參照陳方新等［12］的方法，將供試菌株移至CA上，25℃黑暗培養(yǎng)3 d，用打孔器(d=4 mm)沿菌落邊緣打取菌碟，分別放入含15 ml的10%V8培養(yǎng)液中，每皿4塊菌碟，每菌株3次重復。25℃黑暗培養(yǎng)72 h后，傾去培養(yǎng)液，加入15 ml無菌水，隔12 h后再換一次無菌水，24 h后將產(chǎn)生大量孢子囊的3次重復混合，3 000 r/min勻漿1 min，勻漿后用無菌水定容至50 ml，加入0.05%的吐溫80，經(jīng)磁力攪拌器攪拌充分混勻后，分別配制成孢子囊懸浮液。用微量加樣器吸取5 μl懸浮液于載玻片上拉出1條水帶，置于10×10倍顯微鏡下計數(shù)游動孢子囊數(shù)目。

1.2.3 游動孢子囊產(chǎn)量與致病力的相關性分析。畫出辣椒疫霉游動孢子囊產(chǎn)量與其致病力的散點圖及擬合的線性圖，計算相關系數(shù)(r)，根據(jù)相關系數(shù)大小分析相關程度:r＜0，負相關;r=0，無線性相關;︱r︱ ＞0.95，顯著性相關;︱r︱＞0.80，高度相關;0.50≤︱r︱ ＜ 0.80，中度相關;0.30≤︱r︱ ＜0.50，低度相關;︱r︱ ＜0.30，關系極弱，認為不相關。在P＜0.05水平上有顯著性差異表明有統(tǒng)計學意義［13］。

2 結果與分析

2.1 56個供試菌株的致病力測定結果 56個供試菌株接種辣椒莖稈后均可引起發(fā)病，但不同菌株所致病斑的平均長度有顯著差異(表1)。

表1 辣椒疫霉不同菌株對辣椒植株的致病力測定結果

2.2 安徽省辣椒疫霉游動孢子囊產(chǎn)量 安徽省不同地區(qū)的辣椒疫霉菌株在10%V8培養(yǎng)液中均可產(chǎn)生游動孢子囊且產(chǎn)量存在極顯著差異(表2)。游動孢子囊產(chǎn)量最大的是亳州菌株BZ8，達1.37×104個/ml。合肥菌株 HF2和HF7的游動孢子囊產(chǎn)量最小，僅為2.70×102個/ml。在56個菌株中，有39個菌株的游動孢子囊產(chǎn)量標準偏差小于0.6×103個/ml，占總數(shù)的69.64%;有14個菌株的游動孢子囊產(chǎn)量標準偏差在0.61 ×103～0.90 ×103個/ml，占 25.00%;有3 個菌株的游動孢子囊產(chǎn)量標準偏差在0.91×103～0.99×103個/ml，占5.36%，表明辣椒疫霉游動孢子囊產(chǎn)生能力的穩(wěn)定性較好。

由圖1可知，供試菌株中有11株游動孢子囊產(chǎn)量為0.27×103～1.47×103個/ml，11株為2.13×103～3.87×103個/ml，16 株為 4.07 ×103～6.00 ×103個/ml，11 株為6.33 ×103～7.87 ×103個/ml，3 株為 8.20 ×103～8.87 ×103個/ml，2株為10.33 ×103～11.33 ×103個/ml，2 株為 12.20×103～13.73 ×103個/ml。可見，產(chǎn)孢量中等(4.07 ×103～7.87×103個/ml)的菌株有27個。

表2 安徽省辣椒疫霉的游動孢子囊產(chǎn)量 ×103個/ml

圖1 辣椒疫霉游動孢子囊產(chǎn)量的頻次分布

2.3 辣椒疫霉對辣椒的致病力與游動孢子囊產(chǎn)量的相關性 56個辣椒疫霉菌株中，有的菌株游動孢子囊產(chǎn)量低、致病力弱，有的菌株產(chǎn)孢量高、致病力強，但也有產(chǎn)孢量低、致病力強的菌株。相關性分析表明，辣椒疫霉的游動孢子囊產(chǎn)量與辣椒疫霉對辣椒植株苗的致病力存在一定的相關性，但相關性較小，r=0.165，R2=0.027 2，回歸方程為 y=0.797 7x+40.147(式中x為游動孢子囊產(chǎn)量，y為辣椒疫霉對辣椒致病力引起的病斑長度)(圖2)。因此，在一定范圍內(nèi)辣椒疫霉對辣椒植株苗的致病力強弱與游動孢子囊產(chǎn)量成正相關，但 r=0.165 ＜0.3，認為不相關。

圖2 辣椒疫霉游動孢子囊產(chǎn)量與對辣椒植株苗致病力的相關性

3 討論

游動孢子囊產(chǎn)量是辣椒疫霉主要的生物學特性之一，56個辣椒疫霉菌株在相同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)孢量存在顯著性差異。游動孢子囊產(chǎn)量與菌株的地理來源無關。同時，辣椒疫霉在培養(yǎng)條件(培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分、搖床轉速及搖菌時間)完全一致的情況下游動孢子囊的產(chǎn)量較穩(wěn)定，若其中某一因素發(fā)生變化，產(chǎn)孢量可能會發(fā)生較大改變。關于病菌的產(chǎn)孢能力與致病力的相關性，有研究報道認為稻曲病的產(chǎn)孢能力與致病性有一定的相關性［14－15］，趙純森等則認為禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢量與致病力無顯著相關性［16］。該研究認為辣椒疫霉游動孢子囊產(chǎn)量與致病力不相關，有些產(chǎn)孢量低的菌株致病力卻較強，如菌株HF3和ST1，它們的產(chǎn)孢量分別為1.13 ×103和1.33 ×103個/ml，它們對辣椒苗所致病斑長度分別達63.7和60.2 mm。原因可能是游動孢子囊成熟后釋放的游動孢子數(shù)目存在差異，也可能是菌株游動孢子囊成熟的時間不同;與辣椒疫霉致病力相關的因素不僅僅是產(chǎn)孢量，可能還有辣椒的品種、菌絲生長速率和病菌分泌的毒素。

不同辣椒疫霉菌株產(chǎn)孢量的差異顯然與其菌株的遺傳組成有關，即菌株的基因型決定了該菌株在人工培養(yǎng)基上的表型特征。不同菌株對寄主辣椒植株致病力的強弱程度也必然受菌株的遺傳物質(zhì)控制。而相同地理來源的菌株HF4和HF3對辣椒的病斑長度相差28.4 mm，菌株BZ8和BZ13在10%V8培養(yǎng)液中的游動孢子囊產(chǎn)量相差1.29×104個/ml，一定程度上表明同一地區(qū)的辣椒疫霉存在基因多樣性或遺傳變異等。

［1］HAUSBECK M K，LAMOUR K H.Phytophthora capsici on vegetable crops:Research progress and management challenges［J］.Plant Disease，2004，88:1292 －1303.

［2］LAMOUR K H，STAM R，JUPE J，et al.The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici［J］.Mol Plant Pathol，2012，13:329 －337.

［3］戚仁德，丁建成，顧江濤.辣椒疫霉致病力分化的初步研究［J］.植物保護學報，2002，29(2):189 －190.

［4］孫文秀，張修國，賈永健.不同地區(qū)辣椒疫霉菌遺傳多樣性的RAPD分析［J］.植物病理學報，2005，35(4):340 －344.

［5］王燕華.上海地區(qū)甜椒疫病菌的鑒定［J］.上海農(nóng)業(yè)科技，1982(1):20－21.

［6］周啟明，李林英，楊淑華.辣椒疫病的調(diào)查研究［J］.中國蔬菜，1984(4):40－43.

［7］楊明英，曹繼芬，李向東，等.云南辣椒疫病的分子診斷及其病原菌群體特征研究［J］.植物病理學報，2009，39(3):297 －303.

［8］尹敬芳，曹錦，李健強，等.殺菌劑對辣椒疫霉不同形態(tài)菌體的毒力差異［J］.農(nóng)藥學學報，2005(7):227 －232.

［9］THABUIS AM，PALLOIX A，PFLIEGER S，et al.Comparative mapping of Phytophthora resistance loci in pepper germplasm，evidence for conserved resistance loci across Solanceae and for a large genetic diversity［J］.Theor Appl Genet，2003，106(8):1473 －1485.

［10］SUJKOWSKI L S，PARRA G R，GUMPERTZ M L.Temporal dynamics of phytophthora blight on bell pepper in relation to the mechanisms of dispersal of primary inoculum of Phytophthora capsici in soil［J］.Phytopathology，2000，90:148 －156.

［11］鄭小波.疫霉菌及其研究技術［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

［12］陳方新，齊永霞，高智謀，等.誘導疫霉菌產(chǎn)生游動孢子囊液體培養(yǎng)基的研制［J］.植物保護，2005，31(2):34 －37.

［13］李松岡.實用生物統(tǒng)計［M］.北京:北京大學出版社，2002:202－207.

［14］張君成，陳志誼，張炳欣，等.稻曲病的接種技術研究［J］.植物病理學報，2004，34(5):463 －467.

［15］李燕，于俊杰，劉永鋒，等.稻曲病菌產(chǎn)孢能力及致病力測定［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2012，45(20):4166 －4177.

［16］趙純森，馬星霞，武愛波，等.禾谷鐮刀菌培養(yǎng)性狀與致病力的相關性分析［J］.華中農(nóng)業(yè)大學學報，2005，24(3):254 －257.