貴州茅臺酒高溫發酵工藝中酵母的應激機制分析

◎何 宇

（貴州省仁懷市茅臺鎮懷茅酒廠，貴州 仁懷 564501）

茅臺酒是我國國酒品牌之一，由于貴州省仁懷市茅臺鎮獨特的水源、土壤以及氣候點等特，使得利用該地區微生物和水源釀制的醬香型白酒的味道獨特，留香持久。在釀制過程中主要是通過高溫制曲、堆積、發酵、流酒以及多刀蒸餾和發酵技術才能夠得出純正的茅臺酒，根據現代科技研究茅臺酒中所含有的微量元素種類超過了1400種，是普通醬香型白酒的近3倍。

1 酵母在高溫發酵過程中的應激反應種類

1.1 氧化應激反應

在釀酒過程中外界的環境很容易對菌體造成影響，使活性氧類物質大量累積，當其累積到一定濃度后就會對酵母菌細胞內的物質產生破壞，如變性、斷裂蛋白質鏈等，使細胞產生死亡。但酵母菌已經進化出能夠在此情況下保護自身的特性，主要利用酶類或非酶類物質使其細胞內物質保持原始狀態，進而降低氧化應激反應對其影響。

1.2 高溫應激反應

茅臺酒在釀制過程中需要進行高溫發酵，而通常酵母發酵的穩定應控制在33℃左右，最高不得超過36℃，但在發酵后期酒糟當中的溫度必然無法有效控制，導致酶類物質因受熱而出現鈍化，使得發酵情況停止。而酵母菌本身耐熱應激機制較為復雜，需要接觸耐熱蛋白、海藻糖、應激糖蛋白等的幫助。

1.3 酒精應激反應

酵母對酒精的耐受度也有一定的限制，如果超過該臨界值就會毒害酵母菌。與高溫應激反應相似，高濃度酒精同樣能夠刺激酵母產生海藻糖，而海藻糖除了可以抵消高溫應激反應，還可以抵消酒精應激反應對細胞膜的毒害作用，穩定細胞膜表面蛋白質活性。

2 茅臺酒高溫發酵工藝中酵母的應激機制實驗

2.1 實驗材料

本次實驗所涉及的實驗試劑包括無水乙醇、PMSF、Chaps、尿素、脲、Agarose NA、Tris、冰乙酸、鹽酸、十二烷基硫酸鈉、IAM、DTT、丙烯酰胺、NP40、甲醛、正丁醛、硝酸銀、麥芽糖、甘油、磷酸、戊二醛、過硫酸銨、蛋白胨、蔗糖、葡萄糖、氯化鈣、碳酸鈉以及甲醇等。所使用的實驗器材則包括手持式折光儀、電子天平、恒溫水浴鍋、pH試紙、紫外分光光度儀、電熱干燥箱、真空干燥箱、液氮容器罐、磁力恒溫攪拌器、萬用爐、培養箱、大容量恒溫振蕩器、電泳儀、超聲細胞粉碎機、搖床以及離心機等。

2.2 實驗方法

2.2.1 實驗培養基配置

稱取麥芽粉，將其按照1∶4的比例與水進行混合，并在恒溫磁力攪拌器當中進行糖化，溫度設定在67℃，糖化時間為5 h，然后將液體用紗布進行過濾。根據一份蛋清可以澄清1000ml糖化麥芽粉的比例添加蛋清，并放入水浴鍋中煮沸，再次利用紗布過濾，并在恒溫滅菌鍋內滅菌30m in，放入冰箱內備用。

2.2.2 菌種的活化和培養

將利用斜面保存的實驗菌種接種在配置的麥芽培養基上，在30℃的恒溫條件下培養3d，獲得子一代菌種，然后再將其進行轉接，同樣放置于30℃恒溫條件下培養2d，獲得的菌種供實驗使用。利用接種環分三次將適量的菌種接種在麥芽培養基上，在溫度設定為30℃的恒溫振蕩器當中以每分鐘170 r的頻率培養10 h，并根據每250 ml麥芽培養基上接種振蕩培養總量6%的接種量將其進行轉接，以同樣的條件在恒溫振蕩器中進行培養，獲得實驗用種菌液。

2.2.3 酵母存活率的測定

將處于對數生長期內的酵母細菌分成若干等分，同時使其接受高溫和酒精的刺激，每種刺激時間約為0.5h。使用消毒的蒸餾水將菌液分別稀釋1～5倍，取稀釋后的菌液進行涂板。每個濃度的菌液分別平行涂板三次，在30℃的恒溫培養箱當中培養約32 h，將其與未產生應激反應的酵母菌進行對比。

2.2.4 蛋白質的定量

將培養后收集的菌體轉移到容量為15 ml的離心管當中，用10 ml的無菌蒸餾水對其進行清洗，在振蕩均勻后禁止沉淀。隨后在恒溫離心機內離心約5 min，溫度設定為10℃，速率為2000 r，保留沉淀物質。重復離心兩次后保留沉淀物質，并加入1 ml的無菌蒸餾水溶解，再次用每分鐘3000 r的速率進行離心，保留沉淀物獲得實驗測量的蛋白質。在試管當中加入蛋白質抑制劑，消除其蛋白質的增多，并利用冰浴超聲破碎方法打破其細胞壁，約破碎10 min，并利用每分鐘2000 r的速率進行離心，保留上清液。在上清液當中加入5倍體積的丙酮混合液，在零下20℃條件下沉淀，離心后保留沉淀物，再次用丙酮將混合液中的TCA洗脫，二次冷藏和離心，重復操作兩次后保留沉淀物。

2.3 實驗結果

菌株在培養實驗當中兩種酵母菌株的生長延滯期數據相差不大，但是在對數生長期當中釀酒酵母的生長速率明顯要高于普通酵母，菌體的數量也達到了峰值。以單純高溫對菌株進行刺激的實驗可以看出，在48℃連續刺激30～40 min菌株的活性最大，說明此時其呼吸能力較強，但隨著高溫刺激時間增加，菌株活性減弱，在超過60 min時活性降低到最低點，說明酵母菌發生死亡。而在單純酒精刺激時，在20～30 min之間菌株的活性最強，并且在30 min時活性達到峰值，但之后隨著刺激時間的增加菌株的活性明顯下降。利用高溫和酒精雙重因素刺激時，溫度控制在46℃，酒精濃度為2%，此時在刺激20 min后菌株活性達到峰值，隨后降低。

3 結語

茅臺酒高溫發酵當中酵母的應激機制與溫度和酒精有著很大的聯系，有效控制發酵時間和菌株品種的選擇能提升發酵效果。

[1]季克良,郭坤亮.剖讀茅臺酒的微量成分[J].釀酒科技,2012(10).

[2]路玲玲,檀建新.高溫和高酒精濃度下的酵母特性[J].中國釀造,2014(9).