豆豉纖溶酶的溶血栓作用研究

◎韓 嵐

（呼和浩特職業(yè)學(xué)院 生物化學(xué)工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051）

血栓栓塞性疾病對(duì)于人類(lèi)的健康有很大的影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)威脅生命，且后遺癥嚴(yán)重，是繼癌癥之后的第二大類(lèi)疾病[1]。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)分析表明，全世界死于血栓栓塞性疾病的人數(shù)約為2 600萬(wàn)人/年，我國(guó)每年心血管疾病死亡者占因病死亡總?cè)藬?shù)的40.7%，這一比例遠(yuǎn)高于癌癥，位于各類(lèi)致死疾病的第一位[2]。

使用溶栓酶藥物被認(rèn)為是血栓性疾病最有效的治療方法，如尿激酶、鏈激酶、水蛭素等，但這些藥物都在不同程度上存在著缺點(diǎn)[3]：如分子量較大，不易吸收；半衰期短（僅有3～20 min）；出血性副作用大；成本高，價(jià)格昂貴；只能靜脈給藥，使用不便等，很難被大眾所廣泛接受。

豆 豉 纖 溶 酶（Douchi Fibrinolytic Enzyme，DFE），是繼納豆激酶（Nattokinase，NK）之后發(fā)現(xiàn)的又一種具有強(qiáng)烈溶解血栓纖維蛋白功能的絲氨酸蛋白酶。該酶是從我國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品——豆豉中分離出來(lái)的。2004年，彭勇等[4]測(cè)定了解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）DC-4產(chǎn)生的DFE基因全序列，1 149 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼382個(gè)氨基酸殘基，其中包括77個(gè)氨基酸的前肽和275個(gè)氨基酸的成熟肽。SDS-PAGE和等電聚焦電泳測(cè)得該酶分子量為28 kD，pI=8.0。最適pH值為9.0，最適溫度為48 ℃。DFE不僅可水解纖維蛋白，而且可水解許多人工合成的小分子四肽底物，尤其是枯草桿菌蛋白酶作用底物S-7388（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA），苯甲基磺酰氟（PMSF）可完全抑制其溶纖維活性。這些結(jié)果表明，DFE屬于枯草桿菌蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶，與來(lái)源于納豆枯草芽孢桿菌的納豆激酶同源性為86.1%。研究表明，DFE能直接作用于血栓交聯(lián)纖維蛋白并將其水解，而對(duì)血漿纖維蛋白原不起作用，具有很好的溶栓活性（純化后比酶活達(dá)4 664.0 U/mg）[5]。

近年來(lái)，我國(guó)研究者將豆豉纖溶酶基因分別在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，得到了具有活性的DFE。Zhang 等[6]將解淀粉芽孢桿菌DC-4的豆豉纖溶酶基因在大腸桿菌BL-21中表達(dá)，純化后比酶活可達(dá)4 597.0 U/mg，且證明DC-4菌株所產(chǎn)生的豆豉纖溶酶蛋白需要前肽才能進(jìn)行正確的折疊。肖露 等[7]將解淀粉芽孢桿菌的豆豉纖溶酶基因的前肽及成熟肽序列與淀粉酶基因的啟動(dòng)子及信號(hào)肽融合，轉(zhuǎn)化枯草桿菌，重組豆豉纖溶酶比酶活為5 918.7 U/mg。張仁懷 等[8]將含有和不含前肽的豆豉纖溶酶基因在畢赤酵母中分別進(jìn)行表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)用甲醇誘導(dǎo)時(shí)，在含有前肽的豆豉纖溶酶基因轉(zhuǎn)化的畢赤酵母工程菌的培養(yǎng)液中可檢測(cè)到較強(qiáng)的溶栓酶活性。

目前，開(kāi)發(fā)溶栓能力強(qiáng)、價(jià)格低、副作用小、易吸收以及體內(nèi)半壽期長(zhǎng)的新型溶栓酶藥物是血栓性疾病治療研究的熱點(diǎn)。來(lái)源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的豆豉纖溶酶，可口服給藥，并且用于體內(nèi)溶栓較為安全，有望被開(kāi)發(fā)并研制成使用方便的新型口服溶栓藥物，在治療和預(yù)防血栓病方面有著很好的應(yīng)用前景和廣闊的市場(chǎng)[9]。

[1]孫月娥，王衛(wèi)東，李超.不同溶栓酶的特點(diǎn)、作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（6）：794-798.

[2]桂清.血栓性疾病已成為威脅人類(lèi)健康和生命的重要疾病[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，8（27）：487.

[3]Nakajima N，Taya N，Sumi H. Potent fibrinolytic enzyme from the lysate of Katsuwonuspelamis digestive tract（Shiokara）：purification and characterization[J].Biosci Biotechnol Biochem，1993，57（9）：1604-1605.

[4]PengY，Yang X J，Xiao L，et al. Cloning and expression of a fibrinolytic enzyme （subtilisin DFE）gene from Bacillusamy loliquefaciens DC-4 inBacillus subtilis[J]. ResMicrobiol，2004，155（3）：167-173.

[5]Peng Y，Huang Q，Zhang R H，et al. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi，a traditional Chinese soybean food[J]. CompBiochemPhys B，2003，134（1）：45-52.

[6]Zhang R H，Xiao L，Peng Y，et al. Gene expression and characteristics of a novel fibrinolytic enzyme（subtilisin DFE） in Escherichina coli[J].LettApplMicrobiol，2005，41（2）：190-195.

[7]肖璐，張仁懷，張義正.豆豉溶栓酶工程茵的發(fā)酵條件及重組溶栓酶的分離純化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（1）：66-73.

[8]張仁懷，王海燕，談寧馨，等.豆豉溶栓酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及其產(chǎn)物的純化[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2005，11（5）：623-626.

[9]范曉丹，郭勇.豆豉纖溶酶——一種潛在的新型溶栓藥物[J].生命的化學(xué)，2005，25（5）：427-429.