利用高效液相色譜-蒸發光檢測器法分析鮰魚腦中磷脂組成

盧 航，里 慧，趙景華，何沁峰，李晶晶，丁宇寧，顏 澤，胡建恩（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連　116023）

利用高效液相色譜-蒸發光檢測器法分析鮰魚腦中磷脂組成

盧 航，里 慧，趙景華，何沁峰，李晶晶，丁宇寧，顏 澤，胡建恩*
（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連116023）

對鮰魚腦中的磷脂進行提取純化，利用高效液相色譜-蒸發光檢測器法對鮰魚腦的磷脂含量進行檢測。結果表明：鮰魚腦磷脂中磷脂酰膽堿含量最高，占磷脂含量的45.73%，磷脂酰乙醇胺次之，含量為17.39%，磷脂酰絲氨酸含量為5.01%，磷脂酰肌醇含量為1.20%，相對較低。磷脂標準品在各自的質量濃度檢測范圍內線性關系良好，并且鮰魚腦的磷脂中各組分分離效果良好，對于其他磷脂樣品的測定也具有重要的參考價值。

鮰魚腦；磷脂；高效液相色譜-蒸發光檢測器；定量分析

魚在加工過程中產生大量的副產物，包括魚頭、魚皮、魚骨等。魚頭營養豐富，除含蛋白質、脂肪、鈣、磷、鐵、VB等營養成分之外，還含有豐富的磷脂成分，且主要集中在魚腦中，鰹魚腦中磷脂含量為22.5 mg/100 g濕腦［1］，是可被利用的磷脂資源。目前，磷脂的各種生理調節功能受到人們廣泛關注，現有研究［2］顯示，磷脂具有抗衰老、調節血脂、減少膽固醇、強化腦部功能、提高記憶等功能。Fran［3］發現卵磷脂與記憶功能有關；Harrison等［4］發現磷脂有減少貧血癥狀、增加血色素含量的功能；Friedman等［5］研究發現磷脂能使實驗性動脈粥樣硬化現象減退；Buang等［6］發現磷脂酰膽堿可以緩解大鼠由乳清酸誘導的脂肪肝。

隨著人們生活質量的日益提高，消費習慣也在發生著變化，人們不再只是滿足吃活鮮魚，而是更多地轉向營養化和具有保健功能的魚加工產品。因此，魚類副產物中的生物活性物質的提取和功能特性的改善研究，將為魚類產業帶來更多的經濟價值和社會價值［7］。目前，磷脂分析常用的方法有薄層色譜法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、質譜和氣相色譜-質譜聯用等技術。隨著質譜技術的發展，更為強大的液相色譜-質譜連用技術也用于磷脂的定向定量分析中。液相色譜-質譜連用技術不僅能將磷脂組間分離定量，還有助于未分離的同類磷脂化合物的檢測［8-9］。目前，HPLC法是磷脂分離和定性分析的主要方法。正相色譜分離不同種類的磷脂主要基于頭部基團極性大小；反相色譜分離磷脂主要基于磷脂上脂肪酸酰基鏈的疏水性不同，但是相比而言一般分離度較差，峰重合嚴重［8］。磷脂分析的流動相一般分為2 類：正己烷-異丙醇-水體系和氯仿-甲醇-水（氨水）體系［10］。各種來源的磷脂都是由多種不同分子構型的磷脂分子組成的混合物，并具有差異性，等度洗脫難以完全分離，紫外與示差擇光檢測器不適于梯度洗脫，而蒸發光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）法具有不受梯度洗脫及溶劑、基線干擾，靈敏度高等優點［11］。為此本實驗將對HPLC-ELSD在鮰魚腦磷脂中的應用展開研究。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

鮰魚腦采自江蘇海天灘涂有限公司，于－20 ℃條件下保存。

磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、磷脂酰肌醇（proporphosphatidylinositol，PI）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）標準品美國Sigma公司；正己烷、異丙醇（均為色譜級）瑞典Oceanpak公司；氯仿、甲醇、冰乙酸等其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

LaChrom Elite系列HPLC儀日本日立公司；Chromolith?Performan-ce-Si型正相硅膠色譜柱（100 mm×4.6 mm）德國默克公司；Alltech 2000 ELSD美國Grace公司。

1.3方法

1.3.1鮰魚腦中總脂肪的提取

鮰魚腦總脂肪采用Folch等［12］方法進行提取。將鮰魚腦流水解凍，勻漿后冷凍干燥，取5 g樣品轉移至燒杯中，加入180 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液混合，攪拌，靜置10 min后抽濾，收集濾液，濾渣重復2 次上述操作。將上述所得濾液合并至分液漏斗中，加入質量分數0.9% NaCl溶液，振蕩搖勻后靜置過夜分層，收集下層氯仿層，通過無水硫酸鈉脫水后濾至旋蒸瓶，45 ℃真空旋蒸至干，所得殘余物即為總脂肪。氮氣吹干旋蒸瓶至恒質量后稱質量，旋蒸瓶增加的質量即為總脂肪質量。

1.3.2鮰魚腦中膽固醇含量的測定

參照GB/T 5009.128—2003《食品中膽固醇的測定》［13］方法，測定鮰魚腦中膽固醇含量。

1.3.3鮰魚腦總脂肪組分的分離測定

總脂肪組分的分離測定采用硅膠柱層析法［14］。稱取100 g柱層析硅膠，在105 ℃活化1～2 h，取出冷卻至室溫。采用濕法裝住，將活化好的硅膠加入300 mL氯仿攪拌均勻至沒有氣泡，然后邊攪拌邊緩緩倒入層析柱（35 cm×2.1 cm），待硅膠柱平衡后，將含有600 mg總脂肪的少量氯仿溶液上樣，依次用氯仿洗脫中性脂，丙酮洗脫糖脂，甲醇洗脫磷脂，各自單獨收集后旋蒸至干、稱質量，得到各脂肪組分質量。

1.3.4鮰魚腦磷脂純化

鮰魚腦總脂肪提取液經真空濃縮后，根據磷脂不溶于丙酮的性質，將冷丙酮（4 ℃）倒入總脂肪濃縮液中，不斷攪拌，待沉淀析出后4 000 r/min離心5 min，吸取上清液，冷丙酮清洗沉淀，重復多次，直至上清液無色為止，用氮氣吹干制得鮰魚腦磷脂，于－20 ℃冷凍保存，備用。

1.3.5鮰魚腦磷脂脂肪酸組成分析

制取的鮰魚腦磷脂采用三氟化硼法甲酯化后，參照GB/T 17377—2008《動植物油脂脂肪酸甲脂的氣相色譜分析》［15］的方法，進行鮰魚腦的磷脂脂肪酸組成分析。

1.3.6磷脂樣品的制備

取適量鮰魚腦磷脂樣品，按照一定的質量濃度溶解于正己烷-異丙醇（3∶1，V/V）混合液中。HPLC進樣前使用0.22 μm孔徑有機相濾膜過濾雜質。進樣量為20 μL。

1.3.7鮰魚腦磷脂HPLC分析

ELSD采用分流模式，以空氣作為霧化氣，氣體流速1.7 L/min，漂移管溫度45 ℃。采用三元梯度洗脫，流動相A為正己烷（含0.04%三乙胺）；流動相B為異丙醇；流動相C為13%乙酸溶液。洗脫流速1.5 mL/min，柱溫25 ℃［16］，梯度洗脫程序如表1所示。將PE、PI、PS、PC、SM、LPC標準品分別單獨進樣，記錄出峰時間，以對樣品磷脂進行定性。然后將各種配好的磷脂標準品按梯度進行稀釋，以磷脂標品含量為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。最后，對鮰魚腦的磷脂進行檢測。按其各峰的出峰時間確定磷脂的種類，根據各種磷脂的標準曲線方程計算各磷脂組分的相對含量。

表1　　梯度洗脫流動相組成Table 1　　Ternary gradient mobile phase composition

2　結果與分析

2.1鮰魚腦中脂質組成從表2可以看出，鮰魚腦中總脂肪含量達37.65%；膽固醇占總脂肪比例為1.84%，低于雞蛋中膽固醇含量（4%）［17］。磷脂占總脂肪的比例為43.17%，遠大于大豆的6.67%，低于蛋黃的45.2%［18］。根據前期實驗測定的鮰魚腦中的含水量為85.76%，因此，以濕質量計算鮰魚腦的磷脂含量為23.14 mg/100 g，接近于魚腦濕質量的

表 22 　鮰魚腦中總脂肪含量及膽固醇、中性脂、糖脂和磷脂比例TTaabbllee 22 　TToottaall lliippiiddss ccoonntteennttss aanndd pprrooppoorrttiioonnss ooff cchhoolleesstteerrooll， nneeuuttrraalllliippiiddss， ggllyyccoolliippiiddss aanndd pphhoosspphhoolliippiiddss iinn cchhaannnneell ccaattffi i sshh bbrraaiinn %

2.3%，干質量的16%。據文獻［19］報道扇貝卵巢中磷脂占濕質量的1.0%，干質量的5.5%；鱈魚卵中磷脂占濕質量的2.2%，干質量的7.6%，與這2 種海產類動物原料比較，鮰魚腦的磷脂含量相對較高，因此以鮰魚腦為原料開發磷脂，具有良好的發展空間。

2.2鮰魚腦的磷脂脂肪酸組成

表 33 　鮰魚腦的磷脂中主要的脂肪酸組成Taabbllee 33 　FFaattttyy aacciidd ccoommppoossiittiioonn ooff pphhoosspphhoolliippiiddss ffrroomm tthhee ffi i sshh bbrraaiinn %

由表3可以看出，鮰魚腦磷脂的脂肪酸主要有

C15∶1、C18∶0、C18∶1 n9c、C20∶5 n3、C22∶6 n3，且二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid，EPA）含量分別為12.3%和1.7%。鮰魚腦的磷脂中含有大量的不飽和脂肪酸，約占總脂肪酸的62.77%。

2.3混合磷脂標準品與鮰魚腦的磷脂HPLC分析

由圖1可以看出，在本實驗的洗脫條件下，混合磷脂標準品和魚腦磷脂中的所有磷脂組分均能達到基線分離，峰形良好，并且溶劑峰并不影響各磷脂的分離與定量分析。各磷脂標準品的標準曲線見表4。從表4可以看出，各磷脂標準品的回歸方程的線性相關系數均大于0.99，說明ELSD的輸出信號與進樣量的對應關系在本實驗所選定的檢測范圍之內是線性的。

圖1　 磷脂標準品（AA）　、鮰魚腦的磷脂（B）HPLC-EELLSSDD圖Fig.1　Chromatogram of phospholipids from channel catfi sh brain by HPLC-ELSD

表 4　磷脂標準曲線方程及R2值Table 4　Equations andd R2values of calibration curves for phospholipid standaarrddss

2.4鮰魚腦的磷脂組成

表 55 　鮰魚腦的磷脂組成Taabbllee 55 　PPhhoosspphhoolliippiidd ccoommppoossiittiioonnss ooff cchhaannnneell ffi i sshh bbrraaiinn%

從表5可以看出，在鮰魚腦磷脂中PC是磷脂的重要組成部分，占鮰魚腦的磷脂45.73%。PE同樣也占磷脂組成的很大比例，達到魚腦磷脂的17.39%。在鮰魚腦的磷脂中，存在一定量的PI以及PS，含量分別為1.20%和5.01%。鮰魚腦的磷脂中并未檢測出SM以及LPC。

3　討 論

磷脂作為一種功能性脂質在生命代謝活動中有極其重要的作用［20］，此外，磷脂是天然的表面乳化劑，具有乳化、分散、潤濕、速溶、脫膜、分離等作用［21］。其可以調節脂質代謝，降低血脂中甘油三酯和膽固醇水平。多烯磷脂酰膽堿作為磷脂的一種已在臨床上作為肝病輔助治療藥得到廣泛利用［22］，因此磷脂生物活性包括減肥、抗癌、降血糖等方面［23-25］，也必將越來越受到人們的重視。而對其所含磷脂組成的分析方法，將為其利用提供科學的依據。本實驗利用正己烷-異丙醇-水體系為流動相進行梯度洗脫，在選定的色譜條件下，可以快速對各磷脂類組分完成檢測分析，并且各組分峰的分離效果良好并且線性關系良好，表明該方法是一種快速、準確測定磷脂含量的分析方法，也可應用于其他來源磷脂組成的檢測。

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Determination of Phospholipids in Channel Catfi sh Brain by High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detector （HPLC-ELSD）

LU Hang， LI Hui， ZHAO Jinghua， HE Qinfeng， LI Jingjing， DING Yuning， YAN Ze， HU Jian'en*（College of Food Science and Engineering， Dalian Ocean University， Dalian116023， China）

In this paper， the phospholipids in the brain of channel catfi sh were extracted and purifi ed. A high-performance liquid chromatography equipped with an evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD） was used to analyze the phospholipid components. The results indicated that the content of phosphatidylcholine （PC） was the highest among the detected phospholipids phospholipids in channel catfish brain， which accounted for 45.73% of the total phospholipids，followed by phosphatidylethanolamine （PE）， which accounted for 17.39%. The proportions of phosphatidylserine （PS）and proporphosphatidylinositol （PI） in relative to the total phospholipids were 5.01% and 1.20%， respectively. Under optimized experimental conditions， the respective peak areas were fi nely fitted to a linear model within the indicated range， and each class of phospholipids was separated well. The method also can be applicable for the determination of phospholipids in other samples.

channel catfish brain； phospholipids； high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD）； quantitative analysis

TS254.9

A

1002-6630（2015）24-0177-04

10.7506/spkx1002-6630-201524032

2015-03-24

遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2012257）

盧航（1982—），女，講師，博士，研究方向為海洋副產物利用。E-mail：luhang@dlou.edu.cn

胡建恩（1962—），男，教授，博士，研究方向為海洋副產物利用。E-mail：huje@dlou.edu.cn