大花蕙蘭叢生芽的高頻誘導(dǎo)因素研究*

李國(guó)樹(shù)，崔國(guó)全，羅順聰，徐成東

（1.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000；2.滇中高原生物資源開(kāi)發(fā)與利用研究所，云南 楚雄 675000）

大花蕙蘭叢生芽的高頻誘導(dǎo)因素研究*

李國(guó)樹(shù)1、2，崔國(guó)全1，羅順聰1，徐成東1、2

（1.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000；2.滇中高原生物資源開(kāi)發(fā)與利用研究所，云南 楚雄 675000）

摘要：為研究影響大花蕙蘭叢生芽的高頻誘導(dǎo)因素，以大花蕙蘭無(wú)菌原球莖進(jìn)行叢生芽苗的誘導(dǎo)、再生及生根因素正交試驗(yàn)研究。結(jié)果表明：在1/2 MS+活性炭1.0g/L+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+瓊脂10g/L的培養(yǎng)中，誘導(dǎo)率高達(dá)75.1%，叢生芽苗生長(zhǎng)健壯；在1/2 MS+瓊脂8g/L+活性炭1.0g/L+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖18g/L的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的叢生芽數(shù)量最多，達(dá)5.13倍；6-BA、NAA對(duì)大花蕙蘭叢生芽的誘導(dǎo)及增殖作用顯著；原球莖是誘導(dǎo)大花蕙蘭叢生芽的有效方式。

關(guān)鍵詞：大花蕙蘭原球莖；叢生芽苗；正交試驗(yàn)；誘導(dǎo)率

大花蕙蘭 （Cymbidium hybridum）屬蘭科植物，因其植株強(qiáng)健、葉片舒展、花大、花色多樣、花期長(zhǎng)等特點(diǎn)，深受人們喜愛(ài)。但由于大花蕙蘭很難進(jìn)行種子繁殖［1］和分株繁殖［2-3］，現(xiàn)在多以組培繁殖為主。章鵬程等［4］研究6-BA與NAA濃度梯度配比對(duì)大花蕙蘭外植體的誘導(dǎo)、增殖及分化研究；李杰等［5］應(yīng)用不同濃度的2，4-D、萘乙酸 （NAA）和激動(dòng)素 （KT）對(duì)大花蕙蘭莖段愈傷誘導(dǎo)研究；趙穎等［6］對(duì)花蕙蘭幼根和根兜誘導(dǎo)原球莖，研究表明根兜比嫩根分化率高。以上研究利用大花蕙蘭的莖尖、莖段和根系進(jìn)行研究［4-6］，對(duì)大花蕙蘭的類原球莖誘導(dǎo)叢生芽苗高頻快繁因素未見(jiàn)報(bào)道，因此，本課題用大花蕙蘭無(wú)菌的類原球莖為材料，研究6-BA、NAA、蔗糖和瓊脂對(duì)大花蕙蘭叢生芽的高頻快繁體系，為實(shí)現(xiàn)大花蕙蘭由類原球莖分化為叢生芽的快速繁殖體系提供參考。

1.　材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)條件

1.1.1材料：供試材料為化生學(xué)院組培室保存的大花蕙蘭 （品種：HERO）無(wú)菌原球莖，生長(zhǎng)期均為4周齡，見(jiàn)圖1。

圖1　大花蕙蘭的原球莖

圖2　原球莖誘導(dǎo)叢生芽苗比較圖

1.1.2培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基30ml/瓶。接種后黑暗培養(yǎng)7d，再置于光照強(qiáng)度2500Lx，光照時(shí)間12h/d，培養(yǎng)溫度25±2℃的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1原球莖選擇與處理

接種時(shí)從原球莖團(tuán)上切取單個(gè)大小一致的類原球莖，每瓶接種3點(diǎn)，每組5瓶，每組重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.2.2原球莖誘導(dǎo)叢生芽的因素篩選

以原球莖上誘導(dǎo)出的叢生芽數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)，將大小一致的單個(gè)原球莖接種于1/2 MS+瓊脂8g/ L+活性炭1.0g/L的基本培養(yǎng)基中，以NAA、6-BA及蔗糖用量為變量進(jìn)行正交設(shè)計(jì)篩選。正交設(shè)計(jì)與接種培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表1。

1.2.3誘導(dǎo)叢生芽苗的高頻增殖因素篩選

以叢生芽的增殖倍數(shù)為指標(biāo)，將誘導(dǎo)出來(lái)的叢生芽接種于以1/2 MS+活性炭1.0g/L為基本培養(yǎng)基，以NAA、6-BA、蔗糖、瓊脂為研究因素進(jìn)行大花蕙蘭叢生芽苗的高頻增殖誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選。正交設(shè)計(jì)與接種培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表2。

1.2.4誘根培養(yǎng)

為研究各增殖因素對(duì)叢生芽苗誘導(dǎo)根系的影響，待各處理組分化產(chǎn)生的叢生芽苗長(zhǎng)至株高2～3cm時(shí)，接種于MS+瓊脂10g/L+蔗糖10g/L+活性炭2g/L+香蕉泥100g/L的基本培養(yǎng)基中，用不同濃度的NAA和培養(yǎng)溫度作對(duì)照，培養(yǎng)50d后統(tǒng)計(jì)叢生芽苗的生根效果。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

接種培養(yǎng)后50d統(tǒng)計(jì)結(jié)果：

叢生芽苗誘導(dǎo)率 （%）=（形成叢生芽的外植體個(gè)數(shù)/外植體總數(shù)）×100%；

叢生芽苗的增殖率=產(chǎn)生叢生芽的原球莖數(shù)量/接種原球莖的數(shù)量；

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析。

2.　結(jié)果與分析

2.1誘導(dǎo)叢生芽的因素篩選結(jié)果

將大小一致的單個(gè)原球莖接種于原球莖誘導(dǎo)叢生芽的因素篩選培養(yǎng)基中，每隔5d進(jìn)行培養(yǎng)管理，50d統(tǒng)計(jì)形成叢生芽的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1，大花蕙蘭叢生芽苗生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。

表1　原球莖誘導(dǎo)叢生芽苗試驗(yàn)因素與結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

由表1可見(jiàn)：各組處理誘導(dǎo)的叢生芽苗的數(shù)量有一定差異，最少為52株、最多的達(dá)77株。即：處理組8（各因素的組合式A3B2C1即：1/2 MS+瓊脂8g/L+活性炭1.0g/L+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖18g/L）誘發(fā)的叢生芽數(shù)量最多，達(dá)5.13倍 （77/15），經(jīng)極差分析：RA＞RC＞RB，影響大花蕙蘭原球莖誘導(dǎo)叢生芽的主次順序依次為：6-BA＞蔗糖＞NAA，碳水化合物過(guò)多過(guò)少均不利于叢生芽的誘導(dǎo)。

從叢生芽的出現(xiàn)時(shí)間來(lái)看：通過(guò)觀察，處理組8（各因素的組合式A3B2C1）接種9d后即有少量叢生芽苗出現(xiàn)，50d得到的叢生芽苗生長(zhǎng)翠綠、大小勻稱。

2.2叢生芽苗增殖培養(yǎng)因素的篩選結(jié)果

將誘導(dǎo)出來(lái)的叢生芽接種于不同取量的6-BA、NAA、蔗糖的培養(yǎng)基上，接種50d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的數(shù)量與褐變率，結(jié)果如表2。

表2　叢生芽苗的增殖篩選因素設(shè)計(jì)與結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

由表2可知：最適合大花蕙蘭叢生芽苗增殖的配方是組合3，即A2B2C2D2組合 （1/2 MS+活性炭1.0g/L+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+瓊脂10g/L）。經(jīng)極差分析可知：RA＞RB＞RC＞RD，說(shuō)明在叢生芽苗增殖過(guò)程中生長(zhǎng)素NAA起主要影響作用，其次是細(xì)胞分裂素6-BA和蔗糖，影響因素最小的是瓊脂。并且在試驗(yàn)中大花蕙蘭叢生芽苗的增殖褐化率與激素用量有關(guān)，激素用量越大，褐化率越高。

2.3試管苗生根培養(yǎng)基篩選結(jié)果

待各處理組叢生芽苗長(zhǎng)到2～3㎝高時(shí)，接種于誘導(dǎo)根系的培養(yǎng)基中，以不同濃度的NAA和培養(yǎng)溫度作對(duì)照，培養(yǎng)50d后統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　不同激素和培養(yǎng)溫度對(duì)叢生芽苗生根的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

注：根的生長(zhǎng)狀況以——優(yōu) （根粗壯、有根毛）、良 （根中粗、有根毛）、中 （根細(xì)小）、差（根纖弱）進(jìn)行分級(jí)，并量化 （優(yōu)：4；良：3；中：2；差：1）；k1，k2，為各因素水平1，水平2的均值；R為極值。

通過(guò)觀察，各處理組的叢生芽苗在誘根培養(yǎng)基中植株生長(zhǎng)正常，并均能生根，但是在平均生根條數(shù)、根系長(zhǎng)度、粗度等方面有差異；從表3中也可以發(fā)現(xiàn)：對(duì)各組誘導(dǎo)的叢生芽苗在組合為A2B2中 （即MS+NAA 1.0 mg/L+瓊脂10g/L+蔗糖10g/L+活性炭2g/L+香蕉泥100g/L，28℃下培養(yǎng)），叢生芽苗的生根效果最好，其生根數(shù)平均為2.1條、平均根系長(zhǎng)度為1.23cm、根的質(zhì)量也達(dá)到了優(yōu)，綜合評(píng)分是最高。從極差分析結(jié)果表明，影響大花蕙蘭試管苗生根最主要的因素是生長(zhǎng)素NAA，其次為培養(yǎng)溫度。

3.　結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

3.1.1利用原球莖來(lái)誘導(dǎo)叢生芽苗是實(shí)現(xiàn)大花蕙蘭高頻快繁的有效途徑

大花蕙蘭的莖尖、莖段和根系均可實(shí)現(xiàn)繁殖再生，但是，本研究利用大花蕙蘭原球莖來(lái)誘導(dǎo)叢生芽苗，不僅操作簡(jiǎn)單、繁殖速度快，再生頻率高，而且能夠?qū)崿F(xiàn)大花蕙蘭的高頻快速繁殖。本次試驗(yàn)：將單個(gè)的原球莖接種于1/2 MS+瓊脂8g/L+活性炭1.0g/L+6-BA 2.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+蔗糖18g/L的培養(yǎng)基上大花蕙蘭增殖的叢生芽的數(shù)量最多，達(dá)5.13倍；在1/2 MS+活性炭1.0g/L+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+瓊脂10 g/L的培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽的效果最好，誘導(dǎo)率高達(dá)75.1%，同時(shí)叢生芽苗生長(zhǎng)翠綠、大小勻稱，生長(zhǎng)健壯，叢生芽苗也能快速長(zhǎng)根，快速形成根、莖、葉完整的大花蕙蘭組培苗。

3.1.2不同激素對(duì)大花蕙蘭叢生芽的誘導(dǎo)效果不同

經(jīng)研究結(jié)果可知：影響大花蕙蘭原球莖誘導(dǎo)叢生芽的主要因素是激素配比和蔗糖含量，表現(xiàn)為：6-BA＞蔗糖＞NAA＞瓊脂；在叢生芽苗的高頻增殖倍數(shù)中：NAA起主導(dǎo)作用，其次是6-BA，瓊脂對(duì)大花蕙蘭的叢生芽的增殖影響最小；在叢生芽生根過(guò)程中，MS+NAA 1.0 mg/L+瓊脂10g/L+蔗糖10g/L+活性炭2g/L+香蕉泥100g/L，28℃下培養(yǎng)，叢生芽的生根效果最好。大花蕙蘭試管苗生根最主要的因素是生長(zhǎng)素NAA。

3.2討論

國(guó)內(nèi)對(duì)大花蕙蘭叢生芽苗的高頻快繁體系研究少，谷祝平等用掃描電鏡觀察大花蕙蘭莖尖培養(yǎng)原球莖的形成表明：大花蕙蘭原球莖是由外植體的體細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，通過(guò)培養(yǎng)后才逐步長(zhǎng)出子葉、真葉、假根，形成完整植株［8］。在本次試驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)：6-BA、NAA、蔗糖等是大花蕙蘭叢生芽苗的高頻快繁中所必需的，NAA在叢生芽苗增殖時(shí)起主要影響作用，其次是6-BA，并且增殖褐化與激素用量有關(guān)，激素用量越大，褐化率越高。這一研究結(jié)果表明：6-BA、NAA、蔗糖的合理配比有利于大花蕙蘭叢生芽苗的誘導(dǎo)與生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：

［1］謝為龍，譚群英，王愛(ài)萍.影響大花蕙蘭試管苗培育因素的研究［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，12（02）：231—234.

［2］龍雨躍，李國(guó)樹(shù)，徐成東，等.大花蕙蘭原球莖誘導(dǎo)與增殖研究［J］.楚雄師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28（03）：64—69.

［3］劉陽(yáng)，陳小強(qiáng)，孫寧，等.大花蕙蘭轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展 ［J］.北方園藝，2010（13）：229—231.

［4］章鵬程，陳瑜，鄧衍福，等.6-BA與NAA不同濃度配比對(duì)大花蕙蘭原球莖誘導(dǎo)的影響［J］.杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，11（04）：332—336.

［5］李杰，黃敏仁，王明庥，等.植物外源激素對(duì)大花蕙蘭體胚發(fā)生影響的研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（04）：65—68.

［6］趙穎，劉平生，張南.大花蕙蘭的嫩根與根兜組織快繁技術(shù)研究［J］.內(nèi)蒙古林業(yè)科技，2010，36（03）：48—50.

［7］張晨晨，余家平，蔣琳.大花蕙蘭高頻再生體系的研究 ［J］.植物生理學(xué)通訊，2007，43（06）：1101—1104.

［8］谷祝平，高金城，李柏年，等.大花蕙蘭莖尖培養(yǎng)的掃描電鏡觀察研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，1990，10（2）：128—131.

（責(zé)任編輯徐成東）

中圖分類號(hào)：Q949.718.430.5

文章標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-7406（2015）03-0043-05

*基金項(xiàng)目：由云南省大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)國(guó)家自然科學(xué)基金 （31260095）；云南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目 （IRTSTYN）；生物學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科和楚雄師院校級(jí)重點(diǎn)學(xué)科（05YJJSXK03）項(xiàng)目資助。

收稿日期：2015-01-10

作者簡(jiǎn)介：李國(guó)樹(shù) （1969—），男，彝族，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事植物學(xué)實(shí)驗(yàn)及植物資源開(kāi)發(fā)與利用研究。

Research on High-regeneration Factors on Multiple-buds of Cymbidium hybridum

LI Guoshu，CUI Guoquan，LUO Shuncong&XU Chengdong
（School of Chemistry&Life Sciences，Chuxiong Normal University，Chuxiong，675000，Yunnan Province；Institute for Bio-resources Research and Development of Central Yunnan Plateau，Chuxiong，675000，Yunnan Province）

Abstract：For the study of influencing high frequency on multiple factors of Cymbidium hybridum，by asepsis protocorm used of protocorm for growing seedlings of induction，regeneration and rooting breeding research.Results show that in 1/2 MS+AC 1.0 g/L+NAA 0.4 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+sucrose 25 mg/L+agar cultivation of 10 g/L，the induction rate is as high as 75.1%，cluster bud seedling growth；In 1/2 MS+agar 8 g/L+1.0 g/L+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+sucrose 18 g/ L of medium induced the most number of multiple shoot clumps，up to 5.13 times；6-BA and NAA on induction of proliferation was significant；The bulb is an effective way to induce large fourth multiple shoot clumps investigate.

Key words：Protocorm Cymbidium hybridum；multiple-buds；orthogonal test；induction rate