工程化釀酒酵母合成植物三萜類化合物

朱明，王彩霞，李春,

(1 天津大學化工學院，系統生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；2 北京理工大學生命學院，北京 100081 )

引 言

三萜類化合物是一類由多個異戊二烯單位構成的含有30 個碳原子的烴類含氧衍生物。結構上多為四環三萜或五環三萜。其中代表性的有甘草次酸（Glycyrrhetinic acid）、人參皂苷（Ginsenosides）、白樺脂酸（betulinic acid）、烏蘇酸（ursolic acid）等。根據結構的不同，人參皂苷又分為齊墩果酸型（oleanolic acid）、人參二醇型（protopanaxadiol）、人參三醇型（protopanaxatriol），具體結構式如圖1所示。藥理學證明三萜類化合物具有多樣化的藥理活性，被廣泛應用于醫藥、保健領域。人參皂苷具有較好的抗腫瘤、抗炎癥等功效，是名貴中藥材人參與西洋參的主要成分[1]；甘草酸在保肝[2]、抗病毒[3]、抗過敏[4]、抗癌癥[5]等方面具有非常重要的作用，同時也可作為甜味劑或者食用添加劑[6]。甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA）作為甘草酸生物合成的前體物質，具有相似的醫藥價值，并且極性較弱，容易透過細胞膜，藥物動力學證明甘草酸的功能主要通過甘草次酸的形式實現，它是甘草酸發揮生物活性的基礎[7]；研究證明大豆皂苷同樣具有抗腫瘤[8]、降低膽固醇[9]等保健作用。

目前三萜類化合物的合成主要是通過植物提取，以甘草次酸為例，將植物甘草中提取的甘草酸，加工為銨鹽后再經水解得到甘草次酸。歷經粉碎、過濾、蒸發、濃縮、攪拌、水洗、重結晶、脫色等多個步驟，提取效率低，并且周期長、成本高、對環境破壞較大，僅靠甘草、大豆、人參、柴胡等藥用植物的天然生產，遠遠不能滿足化工、藥物等多個領域對三萜類化合物的需求，如何快速高效可持續地生產是人們遇到的難題。隨著合成生物學的發展，利用微生物來生產萜類等具有重大醫藥價值的化合物得到了越來越多的關注。在代謝途徑層面上，利用合成生物學技術可以對現有的生物合成路徑在微生物細胞工廠中進行重建，或者針對不同宿主，對整個代謝途徑進行重新設計與構建，將基因線路等小零件組裝到微生物細胞工廠中，從而生產特定的目標產物。許多的燃料化學品正是基于此而實現細胞工廠化的生產，如醇類、脂肪酸酯、烴類物質[10]。Liao 等改造大腸桿菌生產異丁醇[11]與正丁醇[12]；Zhang 等[13]利用大腸桿菌組成型生產異丁醇；Keasling 等[14]利用大腸桿菌構建了脂肪酸酯的合成路徑，生物柴油的產率達到了理論值的9.4%。目前在釀酒酵母內已經實現三萜類化合物骨架（如2,3-氧化鯊烯、β-香樹脂醇）的合成，那么如何高效地對三萜骨架進行特異性氧化是人們遇到的又一難題。

本文將對釀酒酵母中三萜類化合物的合成途徑及在此途徑中起關鍵作用的CYP450 氧化酶進行介紹。

1 三萜類化合物合成途徑的解析

自然界中存在兩種萜類合成途徑（圖1）：甲羥戊酸途徑（MVA）與1-脫氧木酮糖-5-磷酸途徑（MEP），兩個途徑均能合成異戊烯基焦磷酸（IPP）與二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），以此為基礎，進一步反應生成香葉基焦磷酸（GPP），法呢基焦磷酸（FPP）。其中GPP 為單萜的合成骨架，FPP 為倍半萜的合成骨架。由 FPP 與 IPP 反應生成的GGPP(香葉基香葉基焦磷酸)為二萜的合成骨架。

MEP 途徑為大腸桿菌唯一的萜類合成途徑，但是該途徑沒有GGPP 合成能力，而且很少能表達有活性的植物來源的CYP450 氧化酶，因此大腸桿菌不適于三萜類物質的生產。相比之下，酵母具有普遍存在于真核生物細胞的MVA 途徑，且自身具有類異戊二烯與固醇的合成途徑，并且在結構上還具有完整的膜系統，非常適合表達有活性的植物來源的CYP450 氧化酶。所以目前三萜化合物的人工合成主要是在酵母細胞內完成的。

MVA 途徑所產生的化合物是許多藥物中間體與化工原料的重要來源，應用十分廣泛。目前許多研究就是針對酵母內MVA 途徑進行改造從而生產目的產物。具有重要醫藥價值的抗瘧疾藥物——倍半萜類青蒿素的生物合成就是最成功的例子。Keasling 等選擇釀酒酵母作為宿主，過量表達HMG輔酶A 還原酶，替換鯊烯合成酶啟動子降低其表達量，使法呢基焦磷酸的產量得到積累，同時引入來源青蒿的紫穗槐-4,11-二烯合成酶、細胞色素CYP450 單氧化酶和NADPH-細胞色素CYP450 氧化還原酶，使釀酒酵母可以直接合成青蒿酸[20]。在此基礎上，在釀酒酵母中引入2 種脫氫酶：乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶，可以將青蒿酸生物合成中由單一的細胞色素氧化酶 CYP71AV1 催化的由amorphadiene 到青蒿酸的3 步反應，轉變為由多個酶（CYP71AV1、CPR1、CYB5、ADH1、ALDH1）催化的3 步反應，大大提高反應效率，從而在酵母中重建了青蒿酸的生物合成途徑，最終經過發酵優化，青蒿酸產量達到25 g·L-1[21]。抗癌藥物二萜類的紫杉醇在生物合成方面的研究也取得了很大的進展：Stephanopoulos 等[22]將紫杉二烯的合成途徑引入大腸桿菌中，并對整個代謝途徑進行優化，獲得高產紫杉二烯的大腸桿菌細胞，產量達到了1 g·L-1。

但是關于三萜類化合物完整的生物合成路徑尚不清晰。以甘草次酸為例，直到2008年，日本的Muranaka 等[17]通過ESTs (表達序列標簽)結合轉錄分析，發現了細胞色素單氧化酶基因CYP88D6，通過體外與酵母體內的酶活檢測，最終確定了此基因編碼的酶可以順序催化β-香樹脂醇11 位上的C 首先羥基化，然后進一步氧化為11-oxo-β-amyrin[17]。在此基礎上，2011年該課題組又發現了一個酶CYP72A154，該酶具有氧化11-oxo-β-amyrin 的能力， 通過三步順序氧化， 兩個中間產物（30-hydroxy-11-oxo-β-amyrin、glycyrrhetaldehyde），實現了由11-oxo-β-amyrin 到甘草次酸的轉化[16]。通過這兩種細胞色素氧化酶的催化功能，實現了由β-

香樹脂醇到甘草次酸的轉化，目前已報道酵母內甘草次酸產量約為15 μg·L-1。其可能的催化過程如圖2 所示。但是兩個氧化酶催化效率比較低，因此還需繼續尋找催化效率更高的酶或對已有的氧化酶進行人工改造提高催化效率，從而最終提高終產物的產量。

圖1 三萜類化合物的生物合成路徑[15-19]Fig.1 Biosynthesis pathway for triterpeneoids[15-19]

圖2 甘草次酸的生物合成路徑[16-17]Fig.2 Biosynthesis pathway for glycyrrhetinic acid[16-17]

在三萜類化合物整個合成途徑的前體物中，β-香樹脂醇的研究最引人注目。鯊烯合酶催化兩個FPP 發生縮合反應生成鯊烯，其在環化酶的催化下生成2,3-氧化鯊烯，β-香樹脂醇合成酶則催化2,3-氧化鯊烯形成齊墩果烷型五環三萜的骨架β-香樹脂醇。但是由于酵母本身缺少以上3 種酶，無法合成β-香樹脂醇。迄今為止，已經從擬南芥、豌豆、紫苑等多種植物中克隆到β-香樹脂醇合成酶基因。Zhang 等[15]的研究表明在釀酒酵母中提高限速酶的表達量，增加前提物供應，可以增加目的產物的產量，β-香樹脂醇產量達到了107 mg·L-1。Li 等利用合成生物學手段，通過染色體重組整合技術，對β-香樹脂醇合成路徑進行了精細的調控，構建出了組成型穩定生產β-香樹脂醇的酵母工程菌，發酵優化后產量達到156.7 mg·L-1（data not published），為以β-香樹脂醇為前體物的其他萜類物質的生物合成奠定了基礎。

2 三萜類合成途徑在釀酒酵母中的組裝

釀酒酵母是單細胞，能進行高密度發酵，遺傳背景清楚，具有良好的生物安全性，并且針對其遺傳改造的方法成熟多樣，因此釀酒酵母被認為是合成天然產物的理想宿主。細胞內三萜化合物合成途徑中各關鍵酶基因正確高效地導入到釀酒酵母中是至關重要的一步。利用釀酒酵母本身具有的同源重組功能可以實現高GC 含量、多片段、大片段（454 kb）在細胞中的精確組裝[23]。Zhang 等[15]利用DNA assembler 方法成功地將三萜合成途徑中的幾個關鍵酶基因片段同時導入到釀酒酵母中，增加了前體物供應，實現了人參二醇型（protopanaxadiol）、人參三醇型（protopanaxatriol）人參皂苷的合成。在多途徑組裝方面，Wingler 等[24]利用迭代拼接法將多基因線路直接組裝到酵母染色體中，運用此方法構建的模擬文庫可以包含104生物合成途徑。在途徑優化方面模塊化的平衡理論有著非常重要的作用。Stephanopoulos 等[22]將紫杉醇合成路徑分為上游前體物供應模塊與下游合成模塊，分別對它們進行構建與優化，從而大幅度提高了紫杉二烯的產量。大規模基因組編輯技術（如CRISPR-Cas9 系統）的飛快發展也為酵母體內的多個靶基因的同時編輯提供了可能。如Keasling 等[25]利用此技術對甲羥戊酸途徑中的5 個基因位點同時進行敲除，使甲羥戊酸產量提高了41 倍。

3 三萜類合成途徑中細胞色素氧化酶的挖掘與應用

CYP450 氧化酶是一類超基因家族編碼的含有血紅素的氧化酶類，廣泛分布于植物、動物、真菌、細菌，具有多樣化的催化功能，參與萜類、生物堿類、甾醇類及其他一些物質的合成與代謝反應，主要催化的反應有羥基化、環氧化、脫羥基化等。自從第一個植物CYP450 氧化酶CYP71A1 在酵母體內成功表達之后[26]，越來越多的植物來源的CYP450 氧化酶在酵母體內進行了功能驗證。如大豆的苯基脲類羥化酶/N-去甲基酶CYP71A10[27]、3,9-二氫紫檀-α-羥化酶CYP93A1[28]、黃酮合酶CYP93B6[29]；擬南芥中的反式肉桂酸-4-羥化酶CYP73A5[30]、阿魏酸-5-羥化酶CYP84A1[31]、對香豆酰-3-羥化酶CYP98A3[32]，還有紅豆杉中的紫杉烷-10β-羥化酶CYP725A1[33]等。

以β-香樹脂醇為前體物合成甘草次酸等三萜類化合物的過程中，細胞色素氧化酶起著決定性的作用。β-香樹脂醇不僅經CYP450 氧化酶催化可以生成甘草次酸，也可在其他CYP450 氧化酶的作用下，生成三萜皂苷類物質。在蘭賽蘭特杜莖山內，β-香樹脂醇經CYP716A15 與CYP87D16 的共同催化，生成十六-羥基齊墩果酸[34]。在苜蓿內，β-香樹脂醇可被CYP93E2 與CYP72A61v2 催化生成大豆皂醇B（soyasapogenol B），或者被 CYP716A12 與CYP72A68v2 催化形成絲石竹酸（gypsogenic acid）[19,35]。在柴胡內，CYP716Y1 與CYP716A12共同催化 β-香樹脂醇生成刺囊酸（echinocystic acid）[36]。

那么如何對起關鍵作用的CYP450 酶進行挖掘呢？截至2013年12月，植物中已經注釋過的細胞色素氧化酶已經超到7512 個[37]，未來越來越多的酶將被發現與注釋。目前對CYP450 氧化酶的挖掘主要利用轉錄組分析的手段。2014年Chen 等[38]對秤星樹的轉錄組進行分析，按照三萜皂苷的結構推斷出可能的合成路徑，并且結合進化分析，從數據庫中尋找可能起催化作用的CYP450 氧化酶。Ghosh等[39]通過茉莉酸甲酯誘導植物羅勒中次級代謝產物的合成，最終發現了388 個響應茉莉酸甲酯的轉錄本，進一步結合代謝分析，發現了編碼α/β-香樹脂醇合成酶的基因。Chen 等[40]利用甘草的EST 數據，結合轉錄組分析，發現參與甘草酸合成途徑中的16 個酶的編碼基因。Dixon 等[41]對基因表達簇的綜合分析，挖掘催化苜蓿中萜類物質合成的酶。2013年Ramilowski 等[42]對甘草的轉錄組（不同產量、組織、季節等）分析發現43882 個unigene，并對可能參與其中的CYP450 氧化酶、轉運蛋白、糖基轉移酶等進行了注釋。這些實驗結果為下一步深入解析甘草次酸合成途徑奠定了堅實的基礎。

但是植物體內三萜及其他萜類的合成路徑的解析，不能簡單地通過轉錄組分析得到。2011年Goossens 等[43]對苜蓿的毛狀根通過反相高效液相色譜-負離子電噴霧離子化與傅里葉變換離子回旋共振質譜[reversedphase liquid chromatography coupled to negative-ion electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (LC ESI FT-ICR MS)]聯用的方式，成功檢測到未知化合物并對其進行分子式的預測分析，在檢測到的79 種皂苷中，61 種是新發現的。這一技術的開發與研究結果將有助于三萜皂苷合成過程中功能基因組學的研究。

在酵母體內CYP450 氧化酶催化的反應中必須有CYP450 氧化酶還原酶（CPR）的參與。CPR 是一種膜錨定蛋白，主要定位于內質網，它擁有3 個輔因子結合域（FMN、FAD、NADPH），其中的一個linker 位于FMN 與FAD/NADPH 之間。CPR 在功能上主要是將NADPH 傳遞來的電子傳遞到CYP450 氧化酶的血紅素上[37,44]。酵母內源的CPR表達量低，并不能有效地傳遞電子，造成電子傳遞效率的不匹配，影響了CYP450 氧化酶最大活力的表達。植物來源的CPR 的表達是酵母體內CYP450 氧化酶高效表達的關鍵。在CPR 的篩選研究中，CPR 大多來自植物本身，如AtCPR1[15]、LjCPR1[17]等。

目前提高CYP450 氧化酶的活力主要是通過對酶分子進行人工改造或適應性進化。2014年Nielsen等[45]對釀酒酵母進行了耐熱的適應性進化研究，發現改變甾醇的類型可以明顯提高酵母的耐熱性，從而為研究酵母的耐熱性奠定了基礎；在植物中，CYP450 氧化酶的表達量明顯高于CPR，因為過量表達CPR 對細胞也會產生毒害作用：電子傳遞不匹配，產生化學活性氧自由基。在一些微生物體內可以通過建立CYP450-CPR 融合蛋白表達的方式來減少對CPR 細胞的毒害，如融合了紅豆杉CPR 的CYP725A4 氧化酶在大腸桿菌宿主表達后顯示了其催化活性[22]。

4 釀酒酵母合成三萜類物質的轉運與過程強化

三萜物質在細胞內合成后很少能分泌到胞外，有些物質的累積對細胞會產生毒害作用，同時對整個合成路徑產生反饋抑制，影響代謝流方向，打破了整個代謝通路的平衡。如果能將代謝產物排出細胞，不僅減少對細胞的傷害，有利于細胞的正常生長，而且能提高目的產物的產量。目前已報道運輸三萜物質的轉運蛋白非常少，植物內僅發現PDR 蛋白參與萜類物質代謝運輸。在煙草中，NpPDR1 蛋白可以轉運二萜香紫蘇醇[46]。

Goossens 等發現添加β-環糊精（β-CD）類物質可以將異源非揮發性疏水三萜類物質運輸到細胞外。β-CD 是多個吡喃葡萄糖單元以α-1,4 鍵結合生成的環狀物質，具有桶裝的外形與內腔，在整個環狀結構中，外側具有多個羥基，呈親水性；內部由氫原子與氧原子構成，具有疏水性，整個空腔可以包裹萜類化合物。由于其中的葡萄糖單體具有5 個手性中心，所以它常作為手性固定相分離光學異構體，在氣相色譜中應用比較廣泛。研究結果表明，添加甲基β-環糊精可促進β-香樹脂醇轉運到細胞外，明顯減少產物的反饋抑制，提高產率。環糊精結構不同，效果差異巨大：甲基β-環糊精（MβCD）效果最好，β-環糊精次之，并且作用效果呈劑量效應，α-環糊精與γ-環糊精則不具有此功能[36]。

5 結 論

本文綜述了釀酒酵母合成三萜類化合物合成路徑及在整個途徑起關鍵作用的CYP450 氧化酶的研究進展。三萜化合物的生物合成是基于酵母內的MVA 途徑，以2,3-氧化鯊烯為底物，經鯊烯合成酶、環化酶催化作用，生成皂苷類人參二醇型與人參三醇型物質，或經β-香樹脂醇合成酶作用形成三萜骨架β-香樹脂醇。此時經不同的CYP450 氧化酶（如CYP88D6、CYP72A154）與其相應的還原酶催化作用下，歷經多種中間產物，最終生成甘草次酸和皂苷類物質。在此過程中，作為宿主的釀酒酵母不斷地被改造與優化、相關代謝數據庫的不斷涌現、產物合成途徑的不斷挖掘、遺傳改造手段和分析方法的不斷創新，必將能實現人工智能、高效的微生物細胞工廠的構建，增加產量，降低成本，最終完成高附加值次生代謝產物綠色可持續的工業化生產。

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