龍牡桂枝湯對(duì)ADHD模型大鼠左右額葉一紋狀體去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)的影響

萬春平 唐彥 何平

摘要：目的觀察龍牡桂枝湯對(duì)注意缺陷多動(dòng)障礙（ ADHD）模型動(dòng)物一幼年自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）左右額葉一紋狀體去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體（ NET）蛋白表達(dá)的影響，探討該藥治療ADHD的作用機(jī)制。方法采用幼年雄性SHR大鼠48只，隨機(jī)分為龍牡桂枝湯高、中劑量組、鹽酸哌甲酯對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，連續(xù)灌胃給藥14天，采用Western-blot法檢測(cè)各組大鼠左右腦前額葉皮質(zhì)、紋狀體NET蛋白表達(dá)水平。結(jié)果用藥后，鹽酸哌甲酯對(duì)照組、龍牡桂枝湯中、高劑量組大鼠右腦前額葉皮質(zhì)和紋狀體的NET蛋白表達(dá)增加，而各實(shí)驗(yàn)組大鼠左腦前額葉皮質(zhì)和紋狀體NET蛋白表達(dá)無明顯變化。結(jié)論龍牡桂枝湯治療ADHD的作用機(jī)制之一與其能上調(diào)右腦前額葉皮質(zhì)、紋狀體的NET蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：龍牡桂枝湯；ADHD模型大鼠；左右腦；NET

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-2349（2015）03-0018-04

兒童多動(dòng)癥又稱注意缺陷多動(dòng)障礙（attention -deficit/hyperactivity disorder，ADHD），是兒童期最常見的行為問題，主要表現(xiàn)為注意力不集中、多動(dòng)和沖動(dòng)等癥狀。大量研究表明本病病理機(jī)制復(fù)雜，是多基因作用下的遺傳性疾病，以鹽酸哌甲酯為代表的中樞興奮劑兇遠(yuǎn)期療效欠佳及藥物的不良反應(yīng)，使其臨床應(yīng)用受到一定限制。中醫(yī)學(xué)通過整體辨證，施行個(gè)體化治療取得較好療效。龍牡桂枝湯是云南省名中醫(yī)，全國(guó)第三、五批老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承指導(dǎo)老師劉以敏主任治療多動(dòng)癥的經(jīng)驗(yàn)方，尤其能提高患兒的注意力[1]，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示龍牡桂枝湯可減少ADHD模型大鼠SHR的白發(fā)活動(dòng)水平，提高非選擇性注意力[2]，為深入探索其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用最常用的ADHD動(dòng)物模型一白發(fā)性高血壓大鼠（SHR），研究龍牡桂枝湯對(duì)左右腦前額葉皮質(zhì)一紋狀體去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體（NET）蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SHR（鼠齡5周），雄性，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，動(dòng)物自由飲食進(jìn)水。1.2儀器和試劑紅外熒光成像掃描系統(tǒng)（Gene公司，型號(hào)：Odyssey CLX），超微量核酸蛋白檢測(cè)儀（美國(guó)Thermo，型號(hào)：NanoDrop2000）。

RIPA蛋白提取試劑盒（碧云天）；BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒（碧云天）；SDS - PAGE蛋白上樣緩沖液（碧云天）；二抗羊抗兔（IRDye 800cw，Li-Cor）；內(nèi)參GADPH（Cell Signaling）；抗大鼠NET抗體（Santa Cruz Biotechnology）。1.3藥物及制備 復(fù)方由桂枝、白芍、生龍骨、生牡蠣、石菖蒲、炙遠(yuǎn)志、浮小麥、小棗、炙甘草組成，由云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診部藥房提供，制成水煎劑后，按高、中劑量給藥，配成含生藥1.8g/mL、0.9g/mL的溶液并充分?jǐn)噭颍昧糠謩e為18g/kg，9g/kg貯于4℃冰箱備用；鹽酸哌甲酯控釋片（美國(guó)ALZA公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)ODA3915），每次灌胃時(shí)當(dāng)場(chǎng)配制，使藥物濃度為0. 375mg/mL，用量為3.75 mg/kg。1.4分組及給藥48只雄性SHR大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，平衡1周后，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（空白組）、鹽酸哌甲酯對(duì)照組（對(duì)照組）、龍牡桂枝湯中劑量組和龍牡桂枝湯高劑量組4組，根據(jù)大鼠蓖警，均按1mL/100g用量灌胃。每日給藥1次，共14d1.5樣品標(biāo)本采集 各組大鼠于灌胃14天后斷頭處死，在冰臺(tái)上迅速分離左右大腦的前額葉皮質(zhì)和紋狀體，速凍后轉(zhuǎn)移至- 80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.6

Western-blot法檢測(cè)標(biāo)本中NET的蛋白表達(dá)稱取100 mg腦組織，加入300uL RIPA細(xì)胞裂解液，勻漿器將組織勻漿，冰上裂解30min，12000 r/min離心10 min，BCA蛋白定量試劑凋成統(tǒng)一濃度，加入SDS上樣緩沖液，煮沸10min后，上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠，在Tris -甘氨酸電泳緩沖液中以60～80V電壓電泳約2h，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，剪取目的條帶后，加入含5%BSA的洗液，置于搖床室溫封閉1～2h；然后加入特異性一抗丁4℃雜交過夜，洗膜后；再加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫溫育1h，洗膜，然后在紅外熒光成像掃描系統(tǒng)800 nm通道掃描成像。以目的蛋白與β-actin蛋白表達(dá)量的比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。2結(jié)果2.1 左右腦前額葉皮質(zhì)NET蛋白的表達(dá)（圖1）在右腦前額葉皮質(zhì)，鹽酸哌甲酯對(duì)照組、復(fù)方中劑量組、高劑量組的NET蛋白表達(dá)較生理鹽水組增加，而左腦各實(shí)驗(yàn)組大鼠前額葉皮質(zhì)的NET蛋白表達(dá)無顯著差異。2.2左右腦紋狀體NET蛋白的表達(dá)（圖2） 在右腦紋狀體，鹽酸哌甲酯對(duì)照組、復(fù)方中劑量組、高劑量組的NET蛋白表達(dá)較生理鹽水組增加，左腦各實(shí)驗(yàn)組大鼠紋狀體的NET蛋白表達(dá)無顯著差異。3討論

國(guó)內(nèi)外大量神經(jīng)影像學(xué)研究證實(shí)：額葉一紋狀體通路異常在ADHD的病理生理機(jī)制中起重要作用，是ADHD發(fā)病機(jī)制的權(quán)威學(xué)說[3]。雖然腦內(nèi)多巴胺（ DA）對(duì)額葉一紋狀體通路的調(diào)控非常重要，但去甲腎上腺（ NE）系統(tǒng)的功能失調(diào)很早就被提出是ADHD的致病因素之一[4]，并成為近年來的研究熱點(diǎn)。NE能系統(tǒng)與視覺注意的增強(qiáng)、適應(yīng)行為的啟動(dòng)、學(xué)習(xí)及記憶有關(guān)，其對(duì)持續(xù)注意缺陷有著更重要的影響。NET是將突觸間隙的去甲腎上腺素重?cái)z取到突觸前神經(jīng)末梢的可溶性載體蛋白，對(duì)維持受體對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性極為重要，研究發(fā)現(xiàn)在前額葉皮層，NE可以通過NET間接調(diào)節(jié)DA釋放，而DA不能調(diào)節(jié)NE釋放[5]。國(guó)內(nèi)學(xué)者錢秋謹(jǐn)研究發(fā)現(xiàn)，在漢族人群中NET1基因可能是單純ADHD，尤其是注意缺陷為主型ADHD的易感基因[6]。多項(xiàng)分子影像學(xué)研究證據(jù)提示[7]：ADHD腦受損以右腦更為明顯；右額葉一紋狀體區(qū)可能為ADHD神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ)，右額前皮質(zhì)區(qū)血流灌注和功能異常是ADHD病理生理基礎(chǔ)。

龍牡桂枝湯由桂枝、白芍、龍骨、牡蠣、浮小麥、小棗、石菖蒲、遠(yuǎn)志、炙甘草組成。方中桂枝，白芍相須為用，收斂浮越陽氣；龍骨、牡蠣潛陽安神；浮小麥養(yǎng)心除煩，小棗益氣養(yǎng)血安神；基于“怪病頑癥多有痰作祟”的理論，龍骨、牡蠣能降逆化痰；石菖蒲豁痰開竅；遠(yuǎn)志清心化痰，均可化無形之痰，以“開心竅，通神明”，炙甘草調(diào)和諸藥，以上九藥合用，潛陽入陰，交通心腎，開竅寧神，蘊(yùn)涵了升降互補(bǔ)、剛?cè)嵯酀?jì)、相反相成的配伍思想，有“調(diào)和陰陽”之妙，尤其能有效改善多動(dòng)癥患兒的注意力，基于NET與注意缺陷確有關(guān)聯(lián)，因此本研究焦距于NET，旨在觀察龍牡桂枝湯提高注意力是否與影響NET有關(guān)。

從目前文獻(xiàn)報(bào)道看，在分子生物學(xué)水平研究復(fù)方治療ADHD的作用機(jī)制，多集中于DA系統(tǒng)，尚無涉及NE系統(tǒng)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在灌服鹽酸哌甲酯和龍牡桂枝湯后，與生理鹽水比較，ADHD模型大鼠右腦前額葉皮質(zhì)和紋狀體的NET表達(dá)增加，但左腦前額葉皮質(zhì)和紋狀體NET的變化并不明顯，提示鹽酸哌甲酯和龍牡桂枝湯治療ADHD的作用機(jī)制，與上調(diào)右腦前額葉皮質(zhì)和紋狀體NET的表達(dá)有關(guān)。這也證實(shí)了龍牡桂枝湯在臨床上改善患兒的注意力，與其能直接作用于ADHD的病位一右腦額葉一紋狀體區(qū)，并影響與注意力密切相關(guān)的NET表達(dá)有關(guān)，有可能通過上調(diào)右腦前額葉皮質(zhì)和紋狀體的NET表達(dá)后，既調(diào)控了NE的重?cái)z取，又間接影響了DA的釋放，從而對(duì)維持腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的平衡以揮一定的作用。由于ADHD發(fā)病的神經(jīng)生化機(jī)制異常復(fù)雜，龍牡桂枝湯如何作用相關(guān)腦區(qū)的其他神經(jīng)遞質(zhì)，以及不同功效的復(fù)方對(duì)NET的影響有何差異，都有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：[1]何平，朱瑛.劉以敏老師辨證治療兒童多動(dòng)癥經(jīng)驗(yàn)初探[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2006，27（1）：5.[2]何平，唐彥，楊若俊，龍牡桂枝湯改善注意缺陷多動(dòng)障礙大鼠行為的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué)，2014，6（6）：203 -205[3]薛紅麗，靜進(jìn)注意缺陷多動(dòng)障礙神經(jīng)心理缺損的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué).婦幼保健分冊(cè)，2004，16（2）：65-67.[4] Arnsten AF，Steere，JC，Hunt RD. The contribution of alpha 2-nora-drenergic mechanisms of prefrontal cortical cognitive function. Potentialsignificance for attenlion - deficit hyperactivity disorder[J]. Arch GenPsychiaty，1996 ，53（5）：448-455.[5] Bymaster FP，Kater JS，Nelson DJ，et al Atomotime increases extracel-luler levels of norepinephrine and dopamine in prefrontal cortex of rat：apotential mechanism for efficacy in aUention deficit/hyperactivity disor-der[J].Neuropsychopharmacology. 2002 ，27（5）：699 -711.[6]王藝，劉璐，錢秋謹(jǐn)，等.去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體基因與單純注意缺陷多動(dòng)障礙的關(guān)聯(lián)研究[J].中國(guó)心理衛(wèi)生雜志，2014，28（2）：114-119.[7]張嘉輝，趙正勤，賈少微.注意力缺陷多動(dòng)障礙分子影像學(xué)進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（31）：159-160.

（收稿日期：2014-10-05）